抗核抗体阴性病例的抗核抗体谱的检测分析与疾病风险的评估

卢　伟，刘斌剑，梁　艳，杨再兴*

(1.中国人民解放军第161医院 检验科，湖北 武汉430010；2.第二军医大学长征医院 实验诊断科，上海200003)



抗核抗体阴性病例的抗核抗体谱的检测分析与疾病风险的评估

卢伟1，刘斌剑1，梁艳2，杨再兴2*

(1.中国人民解放军第161医院 检验科，湖北 武汉430010；2.第二军医大学长征医院 实验诊断科，上海200003)

摘要：目的通过对抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)阴性病例的抗核抗体谱(antinuclear antibody spectrum，ANAs)检测结果的分析，探讨两者之间的关联并进行临床疾病风险的评估。方法对2011年至2014年5月15日6003例门诊和住院不同患者血清ANA阴性病例的ANAs检测结果和临床资料进行统计，分析其结果之间的相互关系及其临床意义。结果6003例ANA阴性标本中，ANAs阳性占10.9%，ANAs阴性占89.1%；抗SSA抗体阳性率最高(3.9%)，抗Ro-52阳性率次之(3.6%)。ANAs阳性标本中，抗Sm、抗SSB、抗Scl-70、抗His抗体弱阳性率均高于阳性率，抗Ro-52抗体阳性率高于弱阳性率，差异均有统计学意义(P<0.05)；单项抗体总阳性率最高(8.7%)；单项抗体弱阳性和阳性病例、二项联合抗体阳性病例、混合联合抗体中一阳一弱病例中，女的阳性率均高于男的，差异有统计学意义(P<0.05)。不同年龄组ANAs阳性患者的阳性率差异也有统计学意义(≤20岁组6.2%、21-49岁组9.5%、≥50岁组12.6%，χ2=21.23，P<0.05)。652例ANAs阳性患者中，自身免疫性疾病(autoimmune disease，AID)患者104例(16.0%)。ANAs阳性患者中阳性抗体在AID的总数为162例，抗RO-52抗体在AID患者阳性率最高(30.9%)，其次为抗SSA抗体(28.4%)。5351例ANAs阴性患者中，AID患者322例(6.0%)。AID患者在ANAs阳性标本中所占的比例高于在ANAs阴性标本的，非AID组在ANAs阳性标本中所占的比例低于在ANAs阴性标本的，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ANA和ANAs两者联合定期的检测，可以有效防止漏诊和误诊，为疾病诊断、治疗及预后评估提供重要的临床价值。

关键词：抗核抗体谱；抗核抗体；自身免疫性疾病；评估

(ChinJLabDiagn,2016,20:0597)

患者血清中存在高效价自身抗体是自身免疫性疾病(AID)的特点之一，也是临床确诊AID的重要依据[1]。本文主要研究抗核抗体(ANA)阴性的标本，对其抗核抗体谱(ANAs)进行全面分析，以探讨其在诊断AID的重要价值。

1材料和方法

1.1对象标本和临床资料来源于上海第二军医大学长征医院，对2011年至2014年5月15日6003例门诊和住院不同患者血清ANA阴性病例的ANAs检测结果和临床资料进行统计，其中男3039例，女2964例，年龄2-96岁，平均年龄48岁，门诊患者1242例，住院患者4761例，确诊AID患者426例，包括类风湿关节炎(RA)109例、强直性脊柱炎(AS)73例、系统性血管炎(SV)47例、肌炎/皮肌炎(PM/DM)46例、干燥综合征(SS)40例、混合结缔组织病(MCTD)39例、系统性红斑狼疮(SLE)25例、原发性胆汁性肝硬化(PBC)16例、克罗恩病(CD)12例、系统性硬化症(SSc)12例、自身免疫性肝炎(AIH)7例，确诊为其他疾病的非AID患者4893例，其他无明确诊断患者684例。所有AID患者的诊断均符合国际相关学会的诊疗指南。主要检测抗核糖核蛋白/Sm抗体(抗nRNP/Sm)抗体、抗Sm(抗Sm)抗体、抗干燥综合征A(抗SSA)抗体、抗Ro-52(抗Ro-52)抗体、抗干燥综合征B(抗SSB)抗体、抗硬皮病70(抗Scl-70)抗体、抗Jo-1(抗Jo-1)抗体、抗双链DNA(抗dsDNA)抗体、抗着丝点蛋白B(抗CENP B)抗体、抗核小体(抗AnuA)抗体、抗组蛋白(抗His)抗体、抗核糖体P蛋白(抗rRNP)抗体等12种不同抗原IgG类抗体的结果。

1.2标本要求空腹抽血，分离血清(3 000 r/min离心10分钟)，当日不能及时检测的置于-20℃冰箱保存。

1.3方法和仪器血清ANA检测试剂盒来自于德国欧蒙(杭州)医学实验诊断有限公司，每个反应区同时有灵长类肝组织切片和HEP-2细胞，采用间接免疫荧光法(IIF)。荧光显微镜品牌型号为德国欧蒙EUROStar Ⅱ。判定结果：抗体滴度<1∶100为阴性，抗体滴度≥1∶100为阳性。血清ANAs检测试剂来自于德国欧蒙(杭州)医学诊断有限公司，ANAs采用免疫印迹法(LIA)。采用配套EUROLineScan软件进行显色结果灰度值扫描分析，判定结果：灰度值≤5为LIA阴性；11-25为LIA弱阳性；>25为LIA阳性。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4统计学处理数据分析用SPSS17.0统计软件进行分析，率的比较采用χ2 检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1ANAs阳性率及弱阳性与阳性例数的比较分析6003例ANA阴性标本中，ANAs阳性为652例(门诊患者181例，住院患者471例)，占10.9%，其中有806个阳性项目(391个弱阳性项目和415个阳性项目)；ANAs阴性为5351例，阴性符合率为89.1%。抗SSA抗体阳性率最高(3.9%)；抗Ro-52阳性率次之(3.6%)。652份ANAs阳性标本中，抗Sm、抗SSB、抗Scl-70、抗His抗体弱阳性率均高于阳性率，抗Ro-52抗体阳性率高于弱阳性率，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2ANAs阳性抗体联合项目阳性率及性别比分析652例ANAs阳性患者中，男264例，女388例。单项抗体阳性总数520例(8.7%)，二项联合抗体阳性总数71例(1.1%)，三项联合抗体阳性总数17例(0.3%)，混合联合抗体阳性总数44例(0.8%)。单项抗体弱阳性和阳性病例、二项联合抗体阳性病例、混合联合抗体中一阳一弱病例中，女的阳性率均高于男的，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3不同年龄组ANAs阳性率分析6003例ANA阴性标本中，≥50岁组的ANAs阳性总阳性率最高(12.6%)，与21-49岁组(9.5%)和≤20岁组(6.2%)比较，差异有统计学意义(χ2=21.23，P<0.05)。ANAs弱阳性组、阳性组和混合组中，≥50岁组最高，21-49岁组次之，≤20岁组最低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表1　6003例ANA阴性标本的ANAs阳性率及弱阳性与阳性的比较

表2　652例ANAs阳性抗体联合项目阳性率及性别比

注:混合联合抗体中，一阳一弱代表一项抗体阳性而另一项抗体弱阳性，一阳二弱代表一项抗体阳性而另二项抗体弱阳性，二阳一弱代表二项抗体阳性而另一项抗体弱阳性。

表36003例ANA阴性标本的ANAs阳性率在各年龄组中的比较

组别总例数(n=652)阳性率[n(%)]≤20岁(n=272)21-49岁(n=2824)≥50岁(n=2907)χ2P值ANAs弱阳性组2963(1.1)133(4.7)160(5.5)10.830.00ANAs阳性组31211(4.0)124(4.4)177(6.1)9.150.01ANAs混合组443(1.1)12(0.4)29(1.0)6.990.03

注:混合联合抗体包含在表3所分ANAs混合组内

2.4ANAs阳性患者中阳性抗体在AID的分布652例ANAs阳性患者中，AID患者104例(其中RA21例、PM/DM18例、SLE14例、MCTD12例、SS11例、AS10例、SV9例、CD3例、PBC2例、SSc2例、AIH2例)，占16.0%；非AID患者456例，占69.9%；未明确诊断患者92例，占14.1%。ANAs阳性患者中阳性抗体在AID的总数为162例，抗Ro-52抗体在AID患者阳性率最高(30.9%)，其次为抗SSA抗体(28.4%)，见表4。

表4　652例ANAs阳性患者中阳性抗体在AID的分布

2.5ANAs阴性患者AID的分布5351例ANAs阴性患者中，AID患者322例，占6.0%；非AID患者4437例，占82.9%；未明确诊断患者592例，占11.1%。322例AID患者中病例最多的为RA(27.3%)，其次为AS(19.6%)，见表5。

表5　ANAs阴性患者中322例AID各病例的分布及所占比例

2.6ANAs阳性及ANAs阴性与AID关系AID患者在ANAs阳性标本中所占的比例高于在ANAs阴性标本的，差异有统计学意义(P<0.05)；非AID组在ANAs阳性标本中所占的比例低于在ANAs阴性标本的，差异有统计学意义(P<0.05)，见表6。

表6　ANAs阳性及ANAs阴性与AID关系分析[n(%)]

3讨论

自身抗体是诊断AID的重要依据，每种AID都伴有特征性的自身抗体谱[2，3]。本文ANAs阳性患者中，抗SSA抗体和抗Ro-52阳性率相对于其他抗体都高。抗Sm、抗SSB、抗Scl-70、抗His抗体弱阳性率均高于阳性率，抗Ro-52抗体阳性率高于弱阳性率，其差异均有统计学意义(P<0.05)。对于每种自身抗体包括弱阳性自身抗体的出现要仔细分析,它们引起AID的可能性有多大，将会倾向哪种AID，这些都是必须考虑的问题。比如：抗Sm抗体、抗dSDNA抗体、抗AnuA抗体、抗His抗体和抗rRNP抗体均是SLE特异性抗体；抗SS-A抗体和抗SS-B抗体与SS密切相关。对于这些特征性抗体出现在ANA阴性标本中我们要引起高度重视。

另外，ANAs阳性患者中单项抗体弱阳性和阳性病例、二项联合抗体阳性病例、混合联合抗体中一阳一弱病例中，女的阳性率均高于男的，差异有统计学意义(P<0.05)。不同年龄组ANAs阳性患者的阳性率差异也有统计学意义(≤20岁组6.2%、21-49岁组9.5%、≥50岁组12.6%，χ2=21.23，P<0.05)。说明自身抗体在女性中更易产生，并随年龄的增长会增加，其原因：老年人细胞凋亡更频繁，接受外界刺激累加量变大[4]；细胞凋亡中降解表达在细胞表面的蛋白通常成为ANAs的靶细胞[5，6]。因而老年女性患AID的风险更大。

本文ANAs阳性患者为652例，确诊AID患者就有104例；ANAs阴性患者为5351例，确诊AID患者就有322例。换言之，6003例ANA阴性标本中确诊AID患者就有426例，占7.1%，这将意味在初筛实验中，有可能会造成AID患者的漏检。因此还必须进行确认试验，并对每个检测结果全面分析，为临床诊断提供准确的信息尤为重要。

当检测结果为IIF-ANA阴性/LIA-ANAs阳性而确诊AID患者时，正如Nielen和Arbuckle等[7，8]认为自身抗体的出现远远早于(甚至提前10年)临床症状的出现和发病，它们可能预示着即将发生某种AID。本文ANAs阳性患者涉及到RA、PM/DM、SLE、MCTD、SS等11种AID患者，AID患者在ANAs阳性中所占的比例高于在ANAs阴性所占的比例，非AID组在ANAs阳性中所占的比例低于在ANAs阴性所占比例，差异均有统计学意义(P<0.05)。说明在ANA阴性而ANAs阳性患者中，AID患者占的比例还是比较大的，当 ANA阴性时，也有必要进行ANAs检测，对临床疾病的诊断有着很大的提示作用，应当随时注意观察病情的变化。ANAs阳性抗体在AID的总数为162例，抗Ro-52抗体在AID患者阳性率最高(30.9%)，其次为抗SSA抗体(28.4%)。抗SSA抗体和抗Ro-52抗体有较高的敏感性，但在多种AID患者均可出现，因而特异性不高。另外，从本文发现11例SS中抗SSA抗体出现11例，18例PM/DM中抗Jo-1抗体出现7例，分别都比在其他AID都高；14例SLE患者中，出现的联合抗体(抗Sm抗体、抗nRNP/Sm抗体、抗dsDNA抗体联合3例；抗dsDNA抗体、抗nRNP/Sm抗体、抗SSA抗体联合3例；抗His抗体、抗rRNP抗体2例；抗nRNP/Sm抗体、抗AnuA抗体联合1例)阳性也相对比在其他AID高。由此可看出，自身抗体出现频率的高低会使得我们更倾向考虑初步诊断为符合本身特征性自身抗体的AID，再结合患者有无典型临床表现，最终做出正确诊断。

当检测结果为IIF-ANA阴性/LIA-ANAs阳性而未确诊AID患者时，说明ANAs阳性也可见于如肾脏疾病、内分泌疾病、感染性疾病、呼吸系统疾病、发热等非风湿性疾病。对于这类患者同样要引起重视，比如在肾脏疾病存在药物诱发的自身抗体，在感染性疾病存在病毒诱发的自身抗体，此时自身抗体的出现可能提示并发AID的机率大，通过定期复查，如果发现病情有所变化，治疗方案也要做相应的调整。

至于以上病例中为何出现ANA阴性而ANAs阳性，原因有：对于同一种特异性抗体(如抗Scl-70抗体)，除了针对HEp-2细胞上典型的靶抗原外，还存在针对细胞其他成分的靶抗原[9]；又比如抗SS-A抗体阳性而ANA阴性的原因可能是HEp-2细胞中SS-A抗原成分少，在制作基质时容易漏出，无法检测[10，11]；另外有可能在疾病初期，ANA含量较少难以被检出或者因临床治疗有效病情得到缓解，总ANA转阴[12]。只有准确分析原因，才能为临床提供有效的信息。

当检测结果为IIF-ANA阴性/LIA-ANAs阴性而确诊AID患者时，多数患者处在疾病早期或经过长期治疗得到很好的控制。本文5351例ANAs阴性患者中，AID患者322例(6.0%)，其中就有5例(MCTD和AS各2例，SLE1例)AID由最初的ANA阴性转为阳性，12例AID(SLE和PM/DM各3例，RA、SV和SS各2例)由最初的ANA阳性转为阴性，而且发现ANA滴度都处在低水平(1∶100)。说明定期检查ANA和ANAs，及早地发现病情和治疗，得到的疗效也是明显的。

此外，临床发现某些症状符合AID而ANA和ANAs全为阴性但又不能确诊AID时，由于ANAs检测的特异性抗体数量极其有限，而AID患者体内存在的自身抗体多达上百种[13，14]，此时对临床是否还需进一步做其他血清学检查起到重要的提示作用。本文6003例ANA阴性标本中，无论ANAs是阴性还是阳性，RA患者所占例数都最高，说明ANA和ANAs对RA的敏感性和特异性均较低[15，16]。而抗环瓜氨酸肽(抗CCP)抗体的检测对RA的诊断有较高的特异性，联合类风湿因子(RF)能很好地用于RA的诊断。对于临床发现没有典型的AID症状而ANA和ANAs全为阴性时，也仅仅提示患者AID的可能性较小，可暂不考虑AID。一旦患者有典型的AID临床表现，无论自身抗体检测结果是否阳性都应长期随访，以免造成漏诊、误诊[17]。因而临床要考虑周全，绝不能简单地当做阴性结果一带而过。

总而言之，对疑为AID的患者进行实验诊断时，应进行ANA和ANAs两者的联合检测，它不但具有一定程度的互补性，对疾病的分型上也具有较高的应用价值[18]。自身抗体可存在于一种AID当中，可存在于多种AID，也可在非AID出现，定期监测ANA和ANAs检测结果，并结合临床表现，对疾病的早期发现、病情判断、治疗及预后评估将提供重要的临床价值。

参考文献：

[1]许渊.抗核抗体谱在自身免疫性疾病中的临床应用[J].检验医学与临床,2012,9(8):945．

[2]仲人前,耿红莲.自身免疫性疾病实验室诊断进展[J].中华检验医学杂志,2005,28(8):867．

[3]Malaguarnera M,Cristaldi E,Romano G,et al.Autoimmunity in the elderly:Implications for cancer[J].J Cancer Res Ther,2012,8(4):520．

[4]杨蓬勃,谢志贤.抗核抗体与衰老的相关性[J].中华老年医学杂志,2010,28(5):394．

[5]Bachmann M，Chang S，Bernd A，et al．Translocation of the nuclear autoantigen La to cell sur face:assembly and disassembly with the extracellular matrix[J].Autoimmunity,1991,9(2):99．

[6]Du L,Fukushima S,Sallmyr A,et al.Exposure of HEp-2 cells to stress conditions influences antinuclear antibody reactivity[J].Clin Diagn Lab Immunol,2002,9(2):287．

[7]Nielen MM,van Schaardenburg D,Reesink HW,et al.Specific autoantibodies precede the symptoms of rheumatoid arthritis:a study of serial measurements in blood donors[J].Arthritis Rheum,2004，50:380.

[8]Arbuckle MR,McClain MT,Rubertsen M,et al.Development of autoantibodies before the clinical onset of systemic lupus erythematosus[J].N Engl J Med,2003,349:1526.

[9]Alessandra D,Cristiane G,Mariana GS,et al.Redefining the Scl-70 indirect immunofluorescence pattern:autoantibodies to DNA topoisomerase I yield a specific compound immunofluorescence pattern[J].Rheumatology,2009,48(6):632．

[10]郭大文,张英辉,单娜,等．抗核抗体核型与条带免疫抗体谱相关性分析[J]．中华实用诊断与治疗杂志,2012,26(6):560．

[11]Yang ZX,Liang Y,Zhong RQ.Is identification of anti-SSA and/or -SSB antibodies necessary in serum samples referred for antinuclear antibodies testing[J]．J Clin Lab Ana,2012,26(6):447.

[12]陈宝萍,任绪义,程新定.抗核抗体阴性标本的抗可提取核抗原谱分析[J].浙江临床医学,2010,12(1):75.

[13]Hu CJ,Zhang FC,Li YZ,et al.Primary biliary cirrhosis:what do autoantibodies tell us[J].World J Gastroenterol,2010,16:3616．

[14]Sherer Y,Gorstein A,Fritzler MJ,et al.Autoantibody explosion in systemic lupus erythematosus:more than 100 different antibodies found in SLE patients[J].Semin Arthritis Rheum,2004,34:501．

[15]刘兰,陈娟.抗核抗体在5种自身免疫病诊断中的应用[J].检验医学与临床.2010,7(2O):2263．

[16]朱蓉,孙明忠,居会祥,等.2771例抗核抗体谱检测结果分析[J].检验医学与临床，2013,10(SupplⅡ):13．

[17]胡朝军,李俊,张道强,等.间接免疫荧光法筛查抗核抗体与特异性抗体检测的相互关系[J].中华临床免疫和变态反应杂志，2011,5(3):179．

[18]孙家祥,李艳.652例抗核抗体阴性病例的抗核抗体谱的检测分析[J].海南医学，2011,22(7):113.

Analysis of the results of antinuclear antibody spectrum which antinuclear antibody were negative and assessment of the risks of disease

LUWei1,LIUBin-jian1,LIANGYan2,etal.

(1.TheClinicalLaboratoryinthe161stHospitalofPLA,Wuhan430010,China;2.DepartmentofLaboratoryDiagnosis,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China)

Abstract:ObjectiveBy analyzing the results of antinuclear antibody spectrum(ANAs) which antinuclear antibody(ANA) were negative,to explore the correlation between them and make clinical assessment of the risks of disease.MethodsMake a statistics of the results of serum ANAs cases which ANA were negative and clinical data of 6003 different patients came from outpatient and?inpatient from 2011 until May 15,2014.The relationship among the results and their clinical significance were analyzed.ResultsOf 6003 ANA negative specimens,the positive rate of ANAs was 10.9%,the negative rate of ANAs was 89.1%,the positive rate of anti-SSA antibody was the first (3.9%),the positive rate of anti-Ro-52 antibody was the second(3.6%).Of ANAs positive specimens,the weakly positive rate of anti-Sm,anti-SSB,anti-Scl-70 and anti-His antibodies were higher than the positive of them,the positive rate of anti-Ro-52 antibody was higher than the weakly positive,there were all with statistical significance (P<0.05).The total positive rate of single event’s antibody was the highest(8.7%).Of the weakly positive cases and positive cases of single event’s antibody,the positive cases of two events’s antibody,the cases of one weak positive and the other positive of mixed events’s antibody,the female positive rate was higher than the male and there was with statistical significance(P<0.05).In the different age group of ≤20 years old,21-49 years old and ≥50 years old,there was statistical significance of ANAs positive rate(6.2%,9.5%12.6%,χ2=21.23,P<0.05).Of 652 ANAs positive specimens,patients diagnosed as autoimmune disease(AID) were 104 cases(16.0%).The positive antibodies of ANAs positive specimens were 162 cases,the positive rate of anti-Ro-52 antibody in the AID group was the first (30.9%),the positive rate of anti-SSA antibody was the second(28.4%).Of 5351 ANAs negative specimens,patients diagnosed as AID were 322 cases(6.0%).The AID patients in ANAs positive specimens were higher than those in ANAs negative specimens,the non-AID patients in ANAs positive specimens were lower than those in ANAs negative specimens,there were both with statistical significance (P<0.05).ConclusionBoth ANA and ANAs are inspected regularly,can effectively prevent missed diagnosis and misdiagnosis,provide important clinical value for disease diagnosis,treatment and evaluation of prognosis.

Key words:antinuclear antibodies；antinuclear antibody；autoimmune disease；assessment

(收稿日期：2015-03-25)

中图分类号：R593.2

文献标识码：A

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)04-0597-06