免疫磁珠阳性筛选联合流式细胞术对胰腺癌外周血循环肿瘤细胞的诊断价值

张菊英,张亚衡

(罗田县人民医院，湖北 黄冈438600)



免疫磁珠阳性筛选联合流式细胞术对胰腺癌外周血循环肿瘤细胞的诊断价值

张菊英,张亚衡*

(罗田县人民医院，湖北 黄冈438600)

摘要：目的通过免疫磁珠阳性筛选联合流式细胞术检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞(CTCs)，探讨其敏感性及诊断价值。方法将我院自2013年06月至2014年12月期间收治67例胰腺癌患者作为观察组，同时选取健康体检者19例作为对照组。采用ACD采血管收集抗凝血7.5 mL，人淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，红细胞裂解处理后加入EPCAM(CD326)抗体标记磁珠，通过MAC分离柱收集CD326抗体阳性细胞，最后加入CD45、Cytokeratin、CD326抗体标记上流式仪检测以获得CTCs个数。将CTCs个数与患者年龄、肿瘤大小、位置、分期、是否远端转移及肿瘤标志物CA19-9进行相关性分析。同时通过对健康体检者血液分别加入5、50、100、500个胰腺癌肿瘤细胞以检测该方法的敏感性。结果观察组中CTCs阳性率达80.6%。CTCs数量与肿瘤分期、是否发生远端转移、血清肿瘤标志物CA19-9显著相关(P<0.01)，与性别、肿瘤位置及大小无关。健康体检者检出CTCs数量均为0个。CTCs的回收率分别为66.7%、86.7%、87.3%及83.3%。结论免疫磁珠阳性筛选联合流式细胞术可有效诊断胰腺癌CTCs，并对评估肿瘤风险有一定的临床价值。

关键词：胰腺癌；循环肿瘤细胞；CA19-9

(ChinJLabDiagn,2016,20:0551)

胰腺癌发病隐匿，大部分胰腺癌患者在确诊时已出现多脏器或远端转移，失去手术机会，5年生存率<5%[1]。CA19-9为临床常用胰腺癌肿瘤标志物，但特异性不高。外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)检测亦称为血液活检，其检测方法主要包括免疫细胞化学法(immunocytochemistry，ICC)、反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)法及Cell Search法等。本实验采用上皮细胞特异的单抗磁珠富集法对CTCs进行初筛，创新性地联合流式细胞术对CTCs进行定量检测，并将计数结果与临床参数进行相关性分析，以此对该法进行应用价值评估。

1材料与方法

1.1一般资料

观察对象为2013年06月至2014年12月期间在我院住院的67例胰腺癌患者。入组标准：①所有病例经病理组织学确诊均为胰腺导管上皮腺癌；②患者入组前均未经治疗处理；③签署知情同意书；④无其它恶性肿瘤病史。排除标准：合并其它恶性肿瘤。同时选取19例体格检查正常，无肿瘤病史健康体检者作为对照组，本实验经医院学术伦理委员会审批并通过。

1.2主要实验仪器及试剂

FACSCanto II流式细胞仪、红细胞裂解液、枸橼酸抗凝血采血管(ACD管)购于美国BD公司。人外周血淋巴细胞分离液购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。MACS buffer、EPCAM(CD326)磁珠、CD45-PE抗体、CK3-6H5-FITC抗体、CD326(EpCAM)-APC抗体、LS磁珠分离柱、QuadroMACSTM分离器均购于德国美天妮公司。5430R台式冷冻离心机购至德国艾本德公司。

1.3CTCs免疫磁性标记、富集和分选

患者在化疗或手术前1天清晨空腹采血。为防止皮肤上皮细胞污染，先抽取5 ml肘静脉抗凝血用作其它检查，再用ACD采血管采集抗凝血7.5 ml检测CTCs。将血液用移液管转入50 ml离心管中，4℃1 200转/min离心20 min，在血细胞中加入HBSS至15 ml，重悬血细胞后，缓慢加至含有15 ml淋巴细胞分离液的50 ml离心管的液(室温)面上，配平后1 200转/min室温离心20 min，吸出雾状单个核细胞层；加入10 ml HBSS 1 200转/min离心5 min去上清，洗两遍，加入5 ml红细胞裂解液工作液(1∶10=浓缩液∶灭菌纯水)重悬细胞，避光室温放置10 min，1 200转/min离心5 min去上清；加入10 ml HBSS重悬细胞，1 200转/min离心5 min，去上清后，加入1 ml HBSS，吹匀后计数，悬液1 200转/min离心10 min，去上清，加入MACS buffer 5 ml重悬细胞，1 200转/min离心5 min，去上清；用余液重悬细胞(细胞数>2×107，需加入MACS buffer)，加入CD326磁珠(20 μl /107个细胞)4℃遮光孵育30 min，用MACS Buffer(107个/L)2 ml洗涤细胞，1 200转/min，离心5分钟，去上清；取LS磁珠分离柱安装于磁板上，用3 ml MACS buffer润洗分离柱，用500 μl MACS buffer(≤50×106)重悬细胞后加入分离柱，等液体全部流出；用3 ml MACS buffer涮洗管壁后加入分离柱(1次)，3 ml MACS buffer 加入分离柱(2次)；加入5 ml MACS buffer然后迅速取出分离柱放于流式管上，取推压器将分离管的液体推入流式管中，1 200转/min离心5 min，去上清；加入1 ml HBSS后重悬细胞，吹匀后计数，1 200转/min离心5 min，去上清；加入抗体CK、CD326、CD45 10 μl(10 μl/106)，充分混匀，重悬细胞，室温避光孵育12 min，再加入4 ml PBS离心清洗1次，去上清后加入500 μl PBS上流式细胞仪检测(或2%甲醛保存过夜第2天检测)。流式细胞仪检测步骤：先在SSC、FSC图上设P1。选择CD45阴性细胞为P2，在P2细胞群中选择CD326和 CK3-6H5阳性细胞群为检测的CTCs细胞，检验标本的CTCs数为每例检测标本细胞数减去阴性对照标本的细胞数。

1.4敏感性实验

将5、50、100、500个人胰腺癌细胞系BxPC-3细胞分别掺入到7.5 ml健康体检者抗凝血液中，免疫磁珠阳性分选、标记相关抗体及流式细胞仪检测CTCs方法与1.3同，实验重复3次取平均值。

1.5肿瘤标志物检测

取患者治疗前空腹清晨静脉血5 ml，3 000 转/min离心10 min，分离血清后上机检测(IA2000 全自动免疫分析仪，日本东曹株式会社)。具体操作按CA19-9定量测定试剂盒(日本东曹株式会社)说明书严格执行。诊断标准以CA19-9>39 U/ml水平为阳性。

1.6统计学方法

2结果

2.1CTCs与患者癌症因素、肿瘤标志物水平相关性分析

观察组年龄32-67岁，平均(41.0±8.9)岁。肿瘤平均最大径为3.7±0.7cm(1.3-6.8cm)。对照组包括男10例，女9例，年龄26-59岁，平均(38.2±7.2)岁。观察组及对照组年龄、性别无统计学差异(P>0.05)。观察组外周血CTCs检出率为80.6%(54/67)，检测到CTCs个数为0-125个，平均1.84个/ml血液。对照组未检测出CTCs，检出率为0.0%(0/19)。CTCs数量与肿瘤分期、是否发生远端转移显著相关(P<0.01)，与性别、肿瘤位置、年龄及肿瘤大小无关(表1)。

表1　CTCs与胰腺癌临床参数的相关性(n=67)

注：a表示Ⅰ期分别与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期CTCs数目相比；b为Ⅱ期与Ⅲ期相比；c为Ⅲ期与Ⅳ期相比；d为Ⅱ期与Ⅳ期相比；

2.2敏感性实验

向7.5 ml血液中分别掺入5、50、100、500个肿瘤细胞的阳性检出率为66.7%、86.7%、87.3%及83.3%。

2.3CTCs与CA19-9的相关性分析

所有入组患者均进行治疗前血清CA19-9检查，结果发现：观察组CA19-9水平阳性率为88.0%(59/67)，平均为(570.3 ±412.8)U/ml。健康对照组CA19-9水平(18.49±6.31)U/ml，阳性率0.0%。观察组中，CTC检验阳性者CA19-9水平与检验阴性者相比，差异有统计学意义(表2)。

表2CTCs与肿瘤标志物CA19-9的相关性

CTC结果nCA19-9(U/ml)P≥149695.9±302.90.0057<118165.8±123.9

注：(CTCs个数/7.5 ml)≥1个判读为阳性结果；<1个为阴性结果。

3讨论

CTCs在外周血的含量稀少，对其进行检测前多先进行CTCs的富集。现常用方法包括密度梯度离心法、滤过富集法以及免疫磁珠分离法[2]。有研究表明，免疫磁珠分离法特异性及敏感度均高于其它富集技术。细胞回收率可达85%，适宜广泛应用。 对富集后的胰腺癌CTCs进行检测的方法主要有以下两种：ICC法及RT-PCR法。①ICC法：主要利用CK、CD45荧光抗体及荧光染料DAPI对细胞分别染色后通过荧光显微镜鉴别计数，结果直观可靠。②RT-PCR法：通常检测多个肿瘤标志物如KRT19、MUC1、EPCAM、CEACAM5、BIRC5等基因来检测CTCs[3]，但核酸来源不能明确且可能出现假阳性结果[1]，单纯RT-PCR法检测不能对CTCs进行定量[10]。③Cellsearch系统：该设备于2010年被美国FDA批准应用于转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的临床检测，其技术原理为免疫磁珠富集法联合ICC法检测CTCs[4]。现该设备已被用于胰腺癌患者外周血CTCs检测并取得一定研究成果[5]。但该设备昂贵且检测项目单一，耗材成本高，国内普及率较低。因此，本研究创新性地利用免疫磁珠富集联合流式细胞术对CTCs进行定量，以求该法对胰腺癌外周血循环肿瘤细胞的诊断价值。

结果发现：19例健康志愿者外周血中均未检出CTCs。5、50、100、500个肿瘤细胞加入体检者血液的CTCs的回收率分别为66.7%、86.7%、87.3%及83.3%，表明该方法鉴定胰腺癌特异度好、敏感性较高。与此同时，通过对入组患者检测结果发现：I期患者检出率为20%(1/5)、Ⅱ期为58.3%(7/12)、Ⅲ期为85.7%(24/28)、Ⅳ期为100%(22/22)，即CTCs数量随肿瘤分期改变在血液中含量升高，提示肿瘤细胞转移进程加快，预后不良，可能与胰腺癌恶性程度高，易于通过血液转移有关，但与性别、肿瘤位置、大小等临床参数无关。另外，入组患者CA19-9的阳性率达88.0%并与CTCs呈正相关，但由于CA19-9在慢性胰腺炎等其它疾病也可能升高，因此，在胰腺癌早期阶段，联合CTCs进行诊断可有助于提高检出率，从而对患者及早进行医学干预减少转移发生。

参考文献：

[1]徐小永,姜维民,于楠,等.胰腺癌循环肿瘤细胞检测及临床应用进展[J].中国普外基础与临床杂志,2015,22 (7):889.

[2]郭新忠,宋丽华,冯斌,等.小细胞肺癌外周血肿瘤细胞定量研究方法的比较[J].中华肿瘤杂志,2013,35 (5):347.

[3]de Albuquerque A,Kubisch I,Breier G,et al.Multimarker gene analysis of circulating tumor cells in pancreatic cancer patients:a feasibility study[J].Oncology,2012,82 (1):3.

[4]王丽娟,张妍,吕昭宝.乳腺癌循环肿瘤细胞与分子生物学特征的相关性分析[J].中国实验诊断学,2015,19 (11):1946.

[5]Bobek V,Gurlich R,Eliasova P,et al.Circulating tumor cells in pancreatic cancer patients:enrichment and cultivation[J].World J Gastroenterol,2014,20 (45):17163.

The Diagnosis Value about the Peripheral Blood Circulating Tumor Cells of Pancreatic cancer by Positive-Screened Immune Magnetic Bead Combine with Flow Cytometry

ZHANGJu-ying，ZHANGYa-heng.

(LuodingPeople’sHospital,HubeiProvince,Huanggang438600,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the sensitivity and diagnostic value about the detect method of peripheral blood circulating tumor cells (CTCs) by immune magnetic beads combined with flow cytometry in pancreatic cancer patients.MethodsFrom June 2013 to December 2014,67 patients with pancreatic cancer were selected as observation group,and 19 healthy patients were selected as control group.After 7.5 mL EDTA anticoagulant blood was drawn and stored with ACD tube,the mononucleocytes were separated from the blood over Ficoll-Paque.the RBCs were removed using a lysis buffer.Labeled cells with CD326 antibodies microbeads,then collected CD326 antibody positive cells through MACS separator.Labeled cells with CD45,Cytokeratin,CD326 antibody and detected the number of CTCs with flow cytometry.We used CTCs number,patient age,tumor size,location,stage,whether the distal metastasis,tumor marker CA19-9 for correlation analysis.At the same time,5,50,100,500 pancreatic cancer cell line cells was added respectively into the control group blood to detect the sensitivity.ResultsIn the observation group,CTCs positive rate was 80.6%.The analyses showed that there was statistically significant difference (P<0.01) in the Number of CTCs between the distal metastasis,tumor stage and serum tumor marker CA19-9,but hasn’t difference between with the sex,tumor location,and tumor size (P>0.05).Control group were detected in CTCs quantity to zero.The recovery rate of CTCs are 66.7%,86.7%,87.3% and 83.3% respectively.ConclusionPositive-screened immune magnetic bead combine with flow cytometry can detect CTCs effectively and has certain clinical value to evaluate the risk of tumor.

Key words:pancreatic cancer;Circulating tumor cells;CA19-9

(收稿日期：2015-05-09)

中图分类号：R735.9

文献标识码：A

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)04-0551-04