清脑止痛胶囊对硝酸甘油偏头痛模型大鼠的影响机制

曲极冰，董秀华，阎　鑫，朱天全，曲　圆，孙申国，薛　欢，胡　杨，纪影实*

(1.吉林大学基础医学院 药理学系，吉林 长春130021；2.长春中医药大学基础医学院；3.吉林敖东洮南药业股份有限公司；4.吉林大学第二医院 骨科)



清脑止痛胶囊对硝酸甘油偏头痛模型大鼠的影响机制

曲极冰1，董秀华2#，阎鑫1，朱天全3，曲圆4，孙申国3，薛欢1，胡杨1，纪影实1*

(1.吉林大学基础医学院 药理学系，吉林 长春130021；2.长春中医药大学基础医学院；3.吉林敖东洮南药业股份有限公司；4.吉林大学第二医院 骨科)

摘要：目的探讨清脑止痛胶囊(QNZTJN)对硝酸甘油致偏头痛大鼠的影响。方法健康雄性Wistar大鼠90只，随机分为6组:空白组、模型组、清脑止痛胶囊低(QNZTJN-L,0.35 g/kg)、中(QNZTJN-M,0.7 g/kg)、高(QNZTJN-H,1.4 g/kg)剂量组、阳性药正天丸组(0.006 g/kg)，每组15只。给药7天后，用皮下注射硝酸甘油(NTG,10 mg/kg)复制大鼠偏头痛模型，观察注射硝酸甘油后180 min内大鼠行为学反应，造模4 h后检测血清及脑干中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、5-羟色胺(5-HT)、降钙素基因相关肽(CGRP)、β-内啡肽(β-EP)含量的变化。 结果与对照组比较，模型组大鼠挠头次数明显增加(P<0.05,P<0.01)，血浆和脑组织NO含量明显升高(P<0.05,P<0.01)，脑组织中NOS、CGRP含量明显升高(P<0.05)，β-EP、5-HT含量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，清脑止痛胶囊中、高剂量组大鼠挠头次数明显减少(P<0.05,P<0.01)，血浆和脑组织NO含量明显降低(P<0.05,P<0.01)，脑组织中NOS、CGRP含量明显降低(P<0.05)，β-EP、5-HT含量明显升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性。结论清脑止痛胶囊可以缓解大鼠偏头痛症状，其机制可能与调节单胺类神经递质释放，进而改善脑及血管的功能障碍有关。

关键词：清脑止痛胶囊；偏头痛；一氧化氮；一氧化氮合酶；降钙素基因相关肽

(ChinJLabDiagn,2016,20:0529)

偏头痛是反复发作的临床常见病，呈一侧或两侧疼痛，发作时常伴有恶心、呕吐[1]。神经生化的代谢紊乱是形成偏头痛的重要因素。研究发现偏头痛与一氧化氮(NO)、5-羟色胺(5-HT)、降钙素基因相关肽(CGRP)、β-内啡肽(β-EP)密切相关[2,3]。但迄今为止，尚无特效药物。本实验采用硝酸甘油致偏头痛大鼠模型，观察清脑止痛胶囊对偏头痛的影响和作用机制。

1材料

1.1实验动物

健康雄性Wistar大鼠90只，体重180 g-220 g，SPF级别，购自吉林大学实验动物中心。

1.2药品及试剂

清脑止痛胶囊由吉林敖东洮南药业股份有限公司生产，正天丸由华润三九医药股份有限公司生产；硝酸甘油注射液由河南润弘制药股份有限公司生产； NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所；大鼠CGRP、β-EP和5-HT酶联免疫检测试剂盒购于安迪生物科技有限公司；NOS2购于艾博抗贸易有限公司；UltraSensitiveTMS-P超敏试剂盒(鼠)、DAB显色试剂盒购于福州市迈新生物技术开发有限公司。

1.3方法

1.3.1分组健康雄性Wistar大鼠90只，适应性喂养一周后，随机分为6组：空白组、模型组、清脑止痛胶囊低(QNZTJN-L)、中(QNZTJN-M)、高剂量组(QNZTJN-H)、正天丸组，每组15只。

1.3.2给药大鼠于造模前预防性给药7 d，灌胃高剂量清脑止痛胶囊1.4 g/kg、中剂量0.7 g/kg、低剂量0.35 g/kg，正天丸剂量为0.006 g/kg。空白组与模型组给予等量的蒸馏水。

1.3.3造模末次给药60 min后，参照文献[4,5]方法，除空白组给予生理盐水外，各组分别于右肩皮下注射NTG 10 mg/kg。

1.3.4行为学评分以30 min为一个时间段， 观察造模后大鼠在6个时间段中的挠头次数。

1.3.5取材和标本处理大鼠皮下注射NTG 4 h 后，用10%水合氯醛麻醉，取血，分离血浆，然后断头取脑，其中10只在冰盒上分离出脑干，制备脑干组织匀浆液，4℃下离心15 min(3 500 r/min)，取上清保存，余5只取脑固定于10%甲醛备用。

1.3.6生化指标检测检测大鼠血浆及脑组织中NO含量，采用酶联免疫法检测大鼠脑组织中CGRP、β-EP、5-HT的含量。

1.3.7免疫组化检测将甲醛固定的脑组织脱水后常规石蜡包埋。将切片脱蜡、脱水，于0.01%枸橼酸缓冲液中抗原修复后，按UltraSensitiveTMS-P超敏试剂盒(鼠)说明进行免疫组化染色。光镜400 倍视野下观察，在每一张切片的中脑导水管周围灰质区随机取5个点，用 Image Pro Plus 6.0 图像分析系统对切片阳性区域表达部分进行平均光密度值测定。

2结果

2.1清脑止痛胶囊对偏头痛大鼠行为的影响

模型组大鼠挠头次数在注射硝酸甘油后30-60min达到最高峰，150-180min左右消失，与对照组比较，模型组大鼠挠头次数明显增加(P<0.05, P<0.01)；与模型组比较，清脑止痛胶囊组大鼠挠头次数随着给药剂量的升高依次降低，且中剂量与高剂量组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05, P<0.01)。见表1。

表1　清脑止痛胶囊对偏头痛模型大鼠挠头次数的影响±s，n=10)

模型组与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；各药物组与模型组比较#P<0.05，##P<0.01

2.2清脑止痛胶囊对偏头痛大鼠血浆及脑组织中NO含量的影响

与对照组比较，模型组大鼠血浆及脑组织中NO的含量升高(P<0.05,P<0.01)；与模型组比较，清脑止痛胶囊中、高剂量组大鼠血浆及脑组织中NO的含量明显降低(P<0.05,P<0.01)，且呈一定剂量依赖性。见表2。

表2　　　　清脑止痛胶囊对偏头痛大鼠模型血清、脑组织中

模型组与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；各药物组与模型组比较#P<0.05，##P<0.01

2.3清脑止痛胶囊对偏头痛大鼠脑组织中NOS含量的影响

与对照组比较，模型组NOS阳性细胞表达增加；与模型组比较，清脑止痛胶囊中、高剂量组大鼠脑组织中NOS阳性细胞表达明显降低(P<0.05,P<0.01)，且呈剂量依赖性。见图1。

与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较#P<0.05，##P<0.01

图1免疫组化染色大鼠中脑导水管周围灰质区

NOS2蛋白表达(400×)

2.4清脑止痛胶囊对偏头痛模型大鼠脑组织β-EP、CGRP、5-HT含量的影响

与对照组比较，模型组大鼠脑组织中CGRP含量增加(P<0.05)，β-EP与5-HT含量降低(P<0.05)；与模型组比较，清脑止痛胶囊高剂量组大鼠脑组织5-HT含量明显升高(P<0.05)，清脑止痛胶囊中、高剂量组大鼠脑组织CGRP含量明显降低、β-EP含量明显升高(P<0.05)，呈一定剂量依赖性。见表3。

组别数量剂量β-EP含量(pg/mg)5-HT含量(ng/mg)CGRP含量(pg/g)空白组10—1.27±0.095.05±0.83217.68±15.73模型组10—0.85±0.07*3.66±0.30*408.81±59.38*正天丸组100.006g/kg1.12±0.10#4.47±0.40235.29±6.24#QNZTJN-L100.35g/kg0.94±0.073.89±0.20377.11±50.48QNZTJN-M100.7g/kg1.06±0.14#4.32±0.79338.02±54.28#QNZTJN-H101.4g/kg1.14±0.09#4.77±0.46#232.55±7.22#

模型组与空白组比较，*P<0.05；各药物组与模型组比较#P<0.05

3讨论

治疗偏头痛的的药物很多，但尚无特效药。西医以镇静止痛对症治疗为主，多数治标不治本；中医药因其辩证施治，对偏头痛治疗有明显的优势。清脑止痛胶囊由天麻、蒺藜、川芎、枸杞子、牛膝、香附、丹参、熟地黄、藁本、细辛组成。主治祛风清脑，化瘀止痛。用于普通型偏头痛肝风夹瘀证。研究表明天麻对中枢神经系统的作用突出，具有明显的镇静催眠作用，还可以扩张血管，改善血管收缩功能及舒张功能，缓解偏头痛[6,7]。川芎是治疗偏头痛的常用药物，已有研究表明川芎能够明显抑制偏头痛大鼠硬脑膜血管因硝酸甘油引起的扩张反应[8,9]。

硝酸甘油(NTG)，能诱导细胞产生一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、环磷酸鸟苷酸(CGMP)等扩血管物质[10,11]。NTG诱发偏头痛模型大鼠的行为表现为耳红、爬笼、挠头，本实验发现注射NTG 5 min左右大鼠出现挠头反应，30-60 min 达到最高峰，150-180 min左右消失，清脑止痛胶囊组大鼠挠头次数得到有效缓解，疗效呈剂量相关性。清脑止痛胶囊能缓解偏头痛模型大鼠的头痛症状。

NO作为特殊的神经递质已被广泛关注，兼有神经递质和效应分子的双层功效。NO通过激活平滑肌中鸟苷酸环化酶, 使细胞内产生大量的cGMP, 从而激活cGMP 依赖的蛋白酶, 后者使肌球蛋白轻链去磷酸化, 并降低细胞内游离钙水平, 使收缩蛋白与Ca2+结合减少导致血管舒张, 引起头痛；同时NO 可引起血管周围神经纤维CGRP、SP、NKA等血管活性物质的释放，增加硬膜细胞因子和诱导型NOS的表达,直接或间接引起神经源性血管扩张，参与偏头痛的发作[12]。本实验研究结果显示硝酸甘油造模偏头痛大鼠血清与脑干中NO含量均显著升高，且脑干中NOS表达升高。

CGRP是多功能神经肽，是迄今为止体内最强的舒血管活性物质，它在疼痛感觉调控中也发挥重要作用，过量释放和由它产生的神经炎症被认为是偏头痛的病理生理基础[13]。偏头痛患者在发作时其颈外静脉血的CGRP 明显升高，用CGRP 受体拮抗剂治疗可使患者的头痛得到缓解及静脉血的CGRP 恢复正常[14,15]。本研究结果显示硝酸甘油注射剂制备的偏头痛大鼠脑干中CGRP含量升高，清脑止痛胶囊给药组大鼠脑干中CGRP含量明显降低。近年研究发现偏头痛与内源性阿片肽系统的障碍密切相关，β-EP 是体内镇痛系统的主要递质， 具有吗啡样的镇痛作用。β-EP 的减少对脑干蓝斑的抑制减弱， 使多种血管活性物质释放， 导致脑血管舒缩功能紊乱，进而促使偏头痛发作[16]。本实验研究结果显示模型组偏头痛大鼠脑干中β-EP含量降低，而清脑止痛胶囊可显著增加其含量。

5-HT是受体和靶细胞的介导物质，产生的生物效应，导致偏头痛，认为5-HT是偏头痛发病的重要因素，目前很多偏头痛药物都是通过5-HT起作用的[17]。 Nagata等报道偏头痛患者在其头痛发作时血中的 5-HT明显减少，付秋菊等发现硝酸甘油型偏头痛大鼠血清5-HT水平明显下降，且研究发现 5-HT 耗竭剂利血平可诱发偏头痛 ,使实验动物血及脑内 5-HT 含量明显下降[18]。本实验结果发现,与正常大鼠比较, 硝酸甘油型偏头痛大鼠脑5-HT含量降低,给予清脑止痛胶囊, 能够增加脑组织中5-HT 含量。

综上，本实验结果表明清脑止痛胶囊可使由NTG诱发的偏头痛模型大鼠脑中 NO、NOS、CGRP 大量生成水平降低，使 β-EP、5-HT大量减少水平升高，从而升高镇痛系统的递质含量、改善脑及血管的功能障碍使之趋于生理状态下的平衡水平，以缓解偏头痛症状。

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Effect of QNZTJN on Migraine in rats induced by nitroglycerin

QUJi-bing,DONGXiu-hua,YANXin,etal.

(DepartmentofPharmacology,CollegeofBasicMedicalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of QNZTJN on rats model of migraine induced by nitroglycerin.MethodsTotally 90 Wistar rats (males) were randomly divided into 6 groups: Control group, QNZTJN low dose gourp (0.35 g/kg), QNZTJN medium dose group (0.75g/kg), QNZTJN high dose group (1.4 g/kg), ZTW group(0.006 g/kg).The migraine models were induced by injecting 10 mg/kg nitroglycerin into the rats to observe the effects of different concentrations of QNZTJN on the level of NO, NOS, 5-HT, CGRP, β-EP in the brain tissue and plasma.ResultsCompared with the normal group, the forelimb scratching frequency of rats were increased significantly in model group(P<0.05,P<0.01),the content of NO in both brain and serum was increased(P<0.05,P<0.01), the contents of CGRP and NOS in brain were increased (P<0.05) , but the contents of β-EP and 5-HT in the brain were decreased significantly(P<0.05,P<0.01).Compared with model group, QNZTJN medium and high dose groups significantly reduced the forelimb scratching frequency of rats(P<0.05,P<0.01), the content of NO in both brain stem and serum was decreased(P<0.05,P<0.01), the contents of CGRP and NOS were decreased(P<0.05) , but the contents of β-EP and 5-HT in the brain stem were increased(P<0.05,P<0.01).These effects were in a dose dependent manner.ConclusionThe QNZTJN can relieve migraine attacks, which may regulate the release of monoamine neurotransmitters,thus improving the function of the brain and vascular disorders.

Key words:QNZTJN; migraine; nitric oxide; nitric oxide synthase; calcitonin generelatiod peptide

(收稿日期：2015-08-24)

中图分类号：R747.2

文献标识码：A

*通讯作者

基金项目：吉林省科技厅项目基金支持(20140310001YY)

文章编号：1007-4287(2016)04-0529-04

# 共同第一作者