电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马内白介素-1β及转录核因子κB抑制蛋白激酶的影响

姜立刚，李　雪，李海平，刘立峰

(1.北华大学附属医院 神经内科,吉林 吉林132011；2.北华大学基础医学院)



电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马内白介素-1β及转录核因子κB抑制蛋白激酶的影响

姜立刚1，李雪1，李海平1，刘立峰2*

(1.北华大学附属医院 神经内科,吉林 吉林132011；2.北华大学基础医学院)

摘要：目的研究分析电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马内白介素-1β和转录核因子κB抑制蛋白激酶的影响。方法将210只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组，分别为60例、75例和75例，灌注后每组根据12 h、24 h和48 h再分为三组。对比各组IL-1β含量和IKKβ的蛋白表达水平。结果模型组各组海马中IL-1β含量均显著高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；电针各组海马中IL-1β含量均显著低于模型各组，差异有统计学意义(P<0.05)。模型各组IKKβ蛋白水平均显著高于假手术各组，差异有统计学意义(P<0.05)；电针各组IKKβ蛋白水平均显低于模型各组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后会出现炎性反应，给予电针干预后可显著降低IL-1β含量和IKKβ的蛋白表达，进而减轻炎症反应。

关键词：电针；白介素-1β；转录核因子κB抑制蛋白激酶

(ChinJLabDiagn,2016,20:0523)

转录核因子κB抑制蛋白激酶(IKKβ)是核因子κB信号通路上游关键的IκB激酶，IKKβ的激活会直接影响到炎性反应的激活[1]。研究显示，电针对于局灶性脑缺血再灌注具有显著临床疗效[2]。本研究使用SD雄性大鼠，观察局灶性脑缺血再灌注损伤后海马区内IKKβ的蛋白表达情况和使用电针后对于IKKβ的影响情况，从而探究电针对于局灶性脑缺血再灌注后海马区内炎性损伤的调节效果。

1资料与方法

1.1一般资料将210只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组，分别为60例、75例和75例，灌注后每组根据12 h、24 h和48 h再分为三组。所有SD大鼠均为雄性清洁级，体质量为280-300 g。大鼠可以自由进食和饮水，在造模前禁食12 h，所有SD大鼠的处置均通过动物伦理委员会认可。

1.2方法

1.2.1电针方法选择大鼠的“百会”穴和左侧“四关”穴作为进针穴位。“百会”穴连接电针方法：一侧电极通过“百会”穴位上的针灸针，与其形成环路的另一电极包湿纱布，固定在右侧后肢部位。“百会”穴平刺0.1cm，“四关”穴直刺0.2 cm，进针后连接至电针治疗仪。刺激参数：疏密波，频率为2 Hz/100 Hz，强度为1 mA，刺激20 min。在缺血2 h后拔出栓子再灌注，即时进行电针治疗。电针12 h组在灌注后12 h处死大鼠前30 min进行电针治疗，总共进行两次电针刺激；电针24 h组分别在拔出栓子时、再灌注后12 h以及再灌注后24 h处死大鼠前30 min进行电针刺激，共进行三次电针刺激；电针48 h组分别在拔出栓子、再灌注后12 h、24 h以及再灌注后48 h处死大鼠前30 min进行电针刺激，共进行四次电针刺激。假手术组和模型组不给予电针刺激。

1.2.2样本取材处理方法所有大鼠在各个观察时间点时使用3.5%水合氯醛进行腹腔麻醉注射。断头取右侧海马组织，然后快速放入-80℃冰箱中冷冻存储。然后V型剪开大鼠肋骨，暴露心脏后使用生理盐水+4%多聚甲醛经心尖灌流固定住大脑组织，然后取出包埋、切片以做免疫化验备用。

1.2.3IL-1β水平测定方法在生理盐水中加比例为100∶1的蛋白酶抑制剂，再将准备好的海马组织剥离后放入预冷玻璃匀浆器中充分研磨，然后放入离心机中离心，离心速度为2 000 r/min，时间为15 min，取出上清作为标本备用。

1.2.4IKKβ蛋白检测方法将石蜡切片(约4 μm厚)放置于二甲苯及梯度乙醇中进行浸泡处理，在3%的双氧水温室中放置5-10 min孵育。确保维持98℃抗原修复半小时左右，再进行20分钟的血清封闭，调节稀释浓度为1∶50，进行孵育一抗IKKβ；再将PBS取代一抗作为阴性对照组，将其放置在4℃冰箱内过夜。此外，应注意37℃烤箱复温60 min左右，添加DAB和二抗显色试剂，进行苏木子复染处理，再进行脱水-透明-封片处理。密切观察每个切片上的5个高倍视野，记录阳性细胞吸光度值情况。

2结果

2.1各组干预后海马内IL-1β含量比较假手术12h组、24h组和48h组海马中IL-1β含量均为0.2ng/ml；模型12h组、24h组和48h组海马中IL-1β含量为1.6ng/ml、1.7ng/ml和1.8ng/ml；电针12h组、24h组和48h组海马中IL-1β含量为1.2ng/mL、1.0ng/ml和1.1ng/ml。模型组各组海马中IL-1β含量均显著高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；电针各组海马中IL-1β含量均显著低于模型各组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

2.2各组干预后海马内IKKβ蛋白水平比较假手术12h组、24组和48组的平均吸光度值为0.15、0.14和0.16；模型12h组、24h组和48h组的平均吸光度值为0.35、0.40和0.44；电针12h组、24h组和48h组的平均吸光度值为0.20、0.20和0.22。模型各组IKKβ蛋白水平均显著高于假手术各组，差异有统计学意义(P<0.05)；电针各组IKKβ蛋白水平均显低于模型各组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　　　　各组干预后海马内IL-1β含量及IKKβ蛋白

注：*与假手术组相比，P<0.05；△与模型各组相比，P<0.05

3讨论

目前已有大量研究证实电针可显著抑制缺血后出现的炎性反应，并且能够显著改善机体免疫能力[3]。IL-1β是在免疫活性细胞激活后出现的免疫调节因子，其能够显著改善炎症给机体组织带来的损伤，但是如果出现过量IL-1β就会导致炎性对机体组织的损伤程度加重[4,5]。IL-1β在脑部中的神经元和星形胶质细胞中产生，能够在各个环节参与神经元的损伤。并且在脑缺血再灌注损伤中，其能够有效激活NF-κB从而诱导炎性反应发生[6]。在本研究结果中可见，模型组各组海马中IL-1β含量均显著高于假手术组，差异显著(P<0.05)；电针各组海马中IL-1β含量均显著低于模型各组，差异显著(P<0.05)。说明电针治疗后能够显著降低炎性因子水平。

NF-κB信号通路是炎性反应中最为关键的部分，IL-1β是活化IKKβ信号通路产生炎性反应的发生和发展的重要激酶[7，8]。所以有效降低IKKβ的活性可显著阻碍NF-κB的激活，从而起到阻碍炎性反应发生的作用[8]。在本研究中，模型各组IKKβ蛋白水平均显著高于假手术各组，差异有统计学意义(P<0.05)；电针各组IKKβ蛋白水平均显低于模型各组，差异有统计学意义(P<0.05)。与秦文熠[9]等研究结果相类似。可见在给予电针治疗后能够显著降低IKKβ蛋白水平，进而降低IKKβ在NF-κB信号通路中的激活作用，最终起到抑制炎性反应的目的。

综上所述，在对于大鼠进行局灶性脑缺血再灌注损伤后会出现炎性反应，给予电针干预后可显著降低IL-1β含量和IKKβ的蛋白表达，进而减轻炎症反应。

参考文献：

[1]李钦潘，王伟，韩永升，等.“醒脑开窍”针刺法对脑缺血再灌注大鼠模型早期运动功能恢复及SYN表达影响的研究[J].中国中医急症，2015，24(01):19.

[2]Chen-chen Xie，Yong Luo，Yue-shan Pang，et al.Effect of electroacupuncture on CD 34+ endothelial progenitor cell counts in bone marrow and peripheral blood in focal cerebral ischemia/reperfusion rats[J].Acupuncture research，2014，39(6):437.

[3]陈吉祥，林浴坤，吴羽楠，等.电针对脑缺血再灌注大鼠学习记忆功能及海马组织Nogo-A/NgR表达的影响[J].中国康复医学杂志，2015，30(03):219.

[4]代恩泽，龙飞，龚标，等.电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠皮质Slit-Robo三磷酸鸟苷酶激活蛋白-1和细胞分裂周期蛋白42表达的影响[J].针刺研究，2015，40(03):186.

[5]赵旺，罗勇，李志伟.穴位电针刺激对局灶性脑缺血再灌注大鼠基质细胞衍生因子/CXC类趋化因子受体4信号轴的影响[J].中华物理医学与康复杂志，2014，36(07):512.

[6]Jing Tao，Bin Chen，Yanling Gao，et al.Electroacupuncture enhances hippocampal NSCs proliferation in cerebral ischemia-reperfusion injured rats via activation of notch signaling pathway[J].The International journal of neuroscience，2014，124(3):204.

[7]陈斌，陶静，黄佳，等.从Notch通路探讨电针促进局灶性脑缺血再灌注大鼠海马神经干细胞增殖的作用机制[J].中国康复医学杂志，2014，29(05):399.

[8]Fan Guo，Tao Jiang，Wenying Song，et al.Electroacupuncture attenuates cerebral ischemia-reperfusion injury in diabetic mice through adiponectin receptor 1-Mediated phosphorylation of GSK-3β[J].Molecular neurobiology，2015，51(2):685.

[9]秦文熠，罗勇，余超.电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马内白介素-1β及转录核因子κB抑制蛋白激酶的影响[J].针刺研究，2013，38(04):271.

Influence of interleukin- β and nhibitorkappa B protein kinase of focal cerebral ischemia hippocampus of rat by electric-needle

JIANGLi-gang，LIXue，LIHai-ping，etal.

(DepartmentofNeurology，AffiliatedHospitalofBeihuaUniversity，Jilin132011，China)

Abstract:ObjectiveTo research and analyse the Influence of interleukin- β and nhibitorkappa B protein kinase of focal cerebral ischemia hippocampus of rat by electric-needle.MethodsTo select 210 male SD rats and randomly divided into the sham-operation group,model group and electric-needle group,they are 60 cases,75 cases and 75 cases.After priming,to divided into three groups as per 12 h,24 h and 48 h.To compared the IL-1β content and protein expression level of IKKβ of them.ResultsThe IL-1β content of the model groups was significantly greater than the sham-operation groups,there was statistical significance (P<0.05).The IL-1βcontent of hippocampus of the electric-needle groups was significantly lower than the model groups,there was statistical significance (P<0.05).The protein expression level of IKKβ of the model groups was significantly lower than the sham-operation group,there was statistical significance (P<0.05).The protein expression level of IKKβ of the electric-needle groups was significantly lower than the model groups,there was statistical significance (P<0.05).ConclusionThat will caused the inflammatory reaction by focal cerebral ischemia hippocampus of rat,and then given the electric-needle for intervening that can help significant decrease the IL-1β content and protein expression level of IKKβ and to help alleviating the inflammatory response.

Key words:Electric-needle;Interleukin-1β;Nhibitorkappa B protein kinase

(收稿日期：2015-07-13)

中图分类号：R743

文献标识码：A

*通讯作者

基金项目：吉林省卫生厅科研项目(2012Z102);吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(吉教科合字2013-441)

文章编号：1007-4287(2016)04-0523-03