壳聚糖/siRNA纳米粒的制备与性能研究*

张德蒙，娄茹云，王　雨，刘袖洞，于炜婷，马小军

(1. 中国科学院 大连化学物理研究所， 辽宁 大连 116023；

2. 大连大学环境与化学工程学院， 辽宁 大连 116622； 3. 中国科学院大学， 北京 100039)



壳聚糖/siRNA纳米粒的制备与性能研究*

张德蒙1,3，娄茹云1,3，王雨1,3，刘袖洞2，于炜婷1，马小军1

(1. 中国科学院 大连化学物理研究所， 辽宁 大连 116023；

2. 大连大学环境与化学工程学院， 辽宁 大连 116622； 3. 中国科学院大学， 北京 100039)

摘要：利用静电自组装法制备了壳聚糖/siRNA纳米粒，建立了SYBR(© )Gold核酸染料法测定siRNA复合率(CR)，并系统性考察了n(N)/n(P)比，壳聚糖分子量(Mw)、脱乙酰度(DD)及制备环境pH值、缓冲液浓度(Bc)对纳米粒siRNA复合率、粒径及表面电位的影响规律。结果表明， siRNA复合率由n(N)/n(P) 0.5时的(18.6±4.0)%快速增大至n(N)/n(P)为2时的(92.9±2.0)%，但随n(N)/n(P)增大复合率不再升高；n(N)/n(P)<2时，难以形成稳定纳米粒，复合物表面电位为负，n(N)/n(P)由5升至150时，纳米粒粒径由(179.3±5.7) nm 增大至(235.5±8.3) nm，表面电位由(17.2±1.3) mV升高至(23.6±0.9) mV。另外，n(N)/n(P) 150时，CR随DD升高而升高，随Bc升高而降低；纳米粒粒径随Mw增大而增大，随DD及缓冲液浓度(Bc)升高而减小；纳米粒表面电位随DD升高而升高，随pH值及Bc升高而降低。n(N)/n(P)比对纳米粒特性及siRNA复合率影响最为显著，调整n(N)/n(P)、Mw、DD、pH值及离子强度可得到siRNA复合率在90%以上，粒径100～300 nm，表面电位15～25 mV的纳米粒。

关键词：壳聚糖；小干扰RNA；核酸染料；复合率

0引言

小干扰RNA (siRNA) 由21～23个碱基对构成，可在细胞质中特异性与其互补的信使RNA (mRNA)结合并使其降解，而阻断蛋白质的表达，即通过RNA 干扰(RNAi) 实现基因沉默。因此，siRNA作为药物在癌症、流感和炎症等病毒感染疾病治疗领域有重要科学意义和应用价值[1-2]。然而，荷负电的亲水性siRNA难以跨越荷负电的疏水性细胞膜，易被核酸酶降解及快速从血液循环中清除，因而需要安全高效的载体装载保护，并将其递送入细胞质中引发RNAi[3-4]。壳聚糖(CS)是阳离子聚合物类siRNA载体中的一种，可生物降解，具有无毒、无刺激、无免疫原性、无致突变性等优点，可在酸性条件下通过质子化的氨基与siRNA磷酸基团间的静电相互作用复合形成纳米粒。因此，CS成为极具吸引力的siRNA载体[5]。尽管CS/siRNA体系在细胞水平实验中获得了很好的基因沉默效果，然而其在体内的沉默实验中获得的结果并不理想[6-7]。

纳米粒siRNA复合率、粒径、表面电位等特性对入胞、转运及siRNA释放有重要影响，直接决定基因沉默的效果。其中，siRNA复合率(即复合态siRNA占总siRNA百分率)直接影响siRNA释放动力学、最终沉默效果及壳聚糖材料优化、成本核算等多个方面。目前siRNA复合率的检测方法有凝胶电泳法、紫外吸收法、核酸染料法等[8-10]。凝胶电泳表征siRNA复合状况，结果直观明了，对比强烈，但实验操作繁琐，耗时长，同时也并非科学的定量方法。紫外吸收法定量siRNA复合率，需要通过离心、超滤等方法分离游离siRNA，可以实现精确定量，但分离操作繁琐，且分离过程对siRNA复合状态产生影响，最终导致得到的复合率结果准确性差。核酸染料法测定siRNA复合率，无需将纳米粒分离，可以实现siRNA的原位检测，重复性好，方便可靠[11]。因此，本文首次将SYBR® Gold核酸染料用于壳聚糖载siRNA体系中siRNA复合率的测定，通过调节壳聚糖氨基与siRNA磷酸基的n(N)/n(P)比，Mw、DD及制备环境pH值、Bc 3个方面的制备条件[6, 12]，系统性地考察这些因素对siRNA复合率、粒径、表面电位等纳米粒特性的影响规律。

1实验

1.1实验材料

壳聚糖(Mw：431 kDa，DD：90%)购自浙江金壳生物化学有限公司，经实验室纯化后利用亚硝酸钠降解及乙酸酐乙酰化反应得到实验用不同Mw、DD样品。siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司，正义链序列为5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT -3’，反义链序列为 5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’。SYBR® Gold核酸染料由美国Molecular Probes 公司提供，焦碳酸二乙酯(DEPC)由美国 Amresco公司提供。实验所有用水均使用DEPC灭RNA酶处理过的Millipore Milli-Q超纯水。

1.2实验方法

1.2.1壳聚糖溶液配制

考察n(N)/n(P)、Mw及DD对纳米粒制备影响时，壳聚糖溶于浓度为0.2 mol/L的醋酸溶液中，配制成浓度为1 mg/mL的溶液，并以浓度为10 mol/L的NaOH调节至pH值为5.5。

考察pH值对纳米粒制备影响时，壳聚糖溶于浓度为0.2 mol/L的冰醋酸中，配制成浓度为1 mg/mL的溶液，以浓度为10 mol/L 的NaOH调节至pH值为6.2并取出1/3体积溶液备用。然后以冰醋酸调节剩余溶液至pH值为5.5，取出剩余溶液体积1/2备用。最后以冰醋酸继续调节剩余溶液至pH值为4.5。

实验通过控制缓冲液浓度(buffer concentration，BC)而获得不同离子强度环境，壳聚糖分别溶于0.02，0.2及1.0 mol/L醋酸溶液中，配制成1 mg/mL溶液并以浓度为10 mol/L 的NaOH调节至pH值为5.5。

制备过程相应条件缓冲液仿照壳聚糖溶液配制。后文若未有特殊说明，则纳米粒制备条件为n(N)/n(P)=150，Mw=158 kDa，DD=80%，pH值=5.5，Bc=0.2 mol/L。

1.2.2CS/siRNA纳米粒制备

根据设定的样品n(N)/n(P)比，以相应pH值、浓度的缓冲液对壳聚糖原液进行稀释， 800 r/min磁力搅拌下缓缓加入浓度为20 μmol/L siRNA 20 μL，继续搅拌10 min，即得CS/siRNA纳米粒。

1.2.3粒径及电位表征

应用动态光散射法(DLS)测定纳米粒粒径，多普勒测速法(LDV)测定纳米粒表面电位。检测使用的仪器为英国马尔文公司的Zetasizer®Nano ZS90，该设备激光器为633 nm波长的HeNe激光器。

1.2.4siRNA复合率测定

siRNA复合率(CR)采用SYBR® Gold核酸染料法测定。将纳米粒加入检测孔中，每孔50 μL，平行5孔。壳聚糖溶液为空白对照；siRNA溶液为siRNA游离对照。取2X SYBR® Gold工作液50 μL与纳米粒混合，避光震荡20 min。随后使用PerkinElmer公司LS-55荧光检测器(美国)检测495 nm激发，545 nm荧光发射强度并得出游离siRNA浓度，进而由式(1)计算得出siRNA复合率CR

(1)

其中，siRNAfree为测得的体系中游离siRNA的量，siRNAtotal为游离对照。

1.2.5统计学分析

所有数据均以平均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，p值<0.05 被认为有显著性差异(*)，p值<0.01 被认为有极显著性差异(**)。

2结果与讨论

CS/siRNA纳米粒用于细胞水平的基因沉默，整个传递过程可以分为：入胞，胞内转运，siRNA释放3个环节，任一环节出现问题都会降低最终的沉默效率[13-14]。siRNA的装载过程决定了siRNA复合状况以及纳米粒粒径、表面荷电性质等物理特性。CS/siRNA粒径及表面电荷直接决定了载体的入胞方式，而纳米粒物理特性及入胞路径又会共同影响其在胞内的转运路径[15, 16]。一旦纳米粒被转运入晚期溶酶体，CS/siRNA将面临多种水解酶的降解甚至被排出胞外[14,17]。CS/siRNA入细胞前应保持纳米粒装载siRNA稳定性的同时，又要确保纳米粒进入细胞后及时将siRNA释放。如果siRNA进入细胞前就发生释放，壳聚糖将失去载体应有的保护作用；而如果纳米粒进入细胞后未能及时将siRNA释放，同样无法发生RNAi。因此，siRNA释放是伴随整个传递过程的重要方面[18]， siRNA复合状况则是决定释放过程的基础。

2.1n(N)/n(P)比对纳米粒性质的影响

n(N)/n(P)比指壳聚糖上氨基(N)与siRNA磷酸基团(P)的摩尔比。通常，制备体系中siRNA浓度是恒定的，n(N)/n(P)比的差异也可以理解为壳聚糖载体浓度的差异。由图1(a)可知，当n(N)/n(P)由0.5升至2时，siRNA复合率由(18.6±4.0)%快速升高至(92.9±2.0)%，但随n(N)/n(P)升高复合率不再变化。同时，n(N)/n(P)低于5时，CS/siRNA体系中并不能形成稳定的纳米结构，测得的复合物表面电位亦为负值。n(N)/n(P)由5升至150时，壳聚糖/siRNA开始形成稳定纳米粒，粒径由(179.3±5.7) nm 增大至(235.5±8.3) nm，表面电位由(17.2±1.3) mV升高至(23.6±0.95) mV(图1(b)、(c))。CS/siRNA自组装复合过程依赖壳聚糖上质子化的氨基和siRNA磷酸基团间的静电相互作用[19]。壳聚糖含量相对较低时，无法与siRNA稳定结合形成纳米粒，但是二者之间的静电作用使得它们有松散的连接，siRNA附着在壳聚糖分子链上使其表面电位为负值，如图1(c)中n(N)/n(P) < 2时的结果。在低n(N)/n(P)下，虽然无法形成稳定的CS/siRNA纳米粒，壳聚糖仍可与siRNA发生络合，而使其无法与SYBR® Gold结合，因此n(N)/n(P)由0.5升至2时，siRNA复合率快速升至90%以上(图1(a))。壳聚糖浓度继续升高时，新增的壳聚糖不断与siRNA层层缠绕包裹而形成稳定的纳米粒，纳米粒粒径与表面电位也随之升高。此时，壳聚糖已经处于过量状态，但核酸染料仍可以与构象变化较小或处于纳米粒外部的siRNA结合，因此测得的siRNA复合率可以维持在90%以上的较高水平但无法达到100%(图1(a))。研究表明，n(N)/n(P)比对纳米粒装载siRNA稳定有重要影响。为了达到最佳的基因沉默效果，需要确保纳米粒在进入细胞前保持siRNA处于受保护的状态，通常n(N)/n(P)在30以上[20-21]。

图1　n(N)/n(P)比对siRNA复合率、粒径及电位的影响

2.2Mw及DD对纳米粒性质影响

Mw及DD是壳聚糖重要的两个结构参数。Mw、DD的变化会导致壳聚糖分子链长、氨基密度、分子内及分子间作用力等的变化，并对壳聚糖分子构象产生影响，进而影响CS对siRNA的装载(siRNA复合率)及纳米粒粒径、表面电位特性[22-24]。如图2(a)-(c)所示，Mw由43 kDa增大至319 kDa时，siRNA复合率无显著变化，CR稳定在92%上下，表面电位由(21.2±0.7) mV小幅波动至(22.5±1.2) mV，并无显著性变化，而纳米粒粒径则由(180.4±4.1) nm快速增大至(278.5±3.6) nm。由图2(d)-(f)可知，DD由67%升高至90%时，siRNA复合率自(86.9±1.5)%显著升高至(94.3±0.1)%，纳米粒粒径由(317.5±6.0) nm大幅降低至(194.9±4.0) nm，同时表面电位则自(18.3±0.9) mV显著升高至23 mV以上。

siRNA分子量为13 kDa，而壳聚糖的分子量在43～319 kDa，同时在高n(N)/n(P)比(150)条件下，大过量的壳聚糖可以充分缠绕包覆siRNA，使得siRNA复合率均在92%左右(图2(a))。另外，Mw增大时，壳聚糖分子链柔性增强，更利于分子间的缠绕结合，因此纳米粒粒径会随之增大(图2(b))，这种构象的变化同时也强化了壳聚糖缠绕结合siRNA的能力。Mw变化时，壳聚糖分子电荷密度并未发生变化，因此纳米粒表面电位可以保持稳定(图2(c))。DD增大时，壳聚糖氨基密度升高，其与siRNA静电作用力更为强烈，形成的纳米粒更致密，纳米粒粒径随之减小(图2(e))。理论上，DD增大时，纳米粒表面电位会因氨基密度的升高而升高，siRNA复合率也会因结合力的增大而增强。然而在n(N)/n(P) 为150条件下，大过量的壳聚糖会掩盖这种理论上的变化，使得纳米粒表面电位及siRNA复合率并未随DD升高时出现大幅提高(图2(d)、(f))。

图2Mw、DD对纳米粒粒径、电位及siRNA复合率的影响

Fig 2 Influence ofMw andDDon nanoparticle size, zeta-potential andCR

2.3pH值及缓冲液浓度影响

pH值及Bc均可影响壳聚糖氨基的荷电状态，而这种荷电状态的变化除了直接影响CS/siRNA复合过程外，还可以通过改变壳聚糖构象对复合过程产生影响。由图3(a)-(c)可知，pH值由4.5增大至6.2时，siRNA复合率未见明显变化，CR稳定在约93%，纳米粒粒径由(209.2±2.2) nm增大至(216.0±3.2) nm，但并无统计学差异，而纳米粒表面电位由(23.8±1.0) mV显著降低至(19.4±1.2) mV。醋酸缓冲液浓度Bc由0.02 mol/L升高至1 mol/L时，CR自(98.2±0.1)%大幅降至(70.6±0.4)%，纳米粒粒径由(202.8±2.2) nm显著减小(173.7±2.9) nm，表面电位自(32.5±1.2) mV大幅降低至(14.8±0.3) mV，如图3(d)-(f)所示。

图3pH值、缓冲液浓度对纳米粒粒径、电位及siRNA复合率的影响

Fig 3 Influence of pH andBc on particle size, zeta-potential andCR

pH值升高时，壳聚糖氨基质子化率降低，而致纳米粒表面电位下降(图3(b))。环境pH值升高会导致壳聚糖电荷密度降低进而减弱静电相互作用[25]，使得纳米粒结构变得更松散的同时siRNA复合率亦有所降低。然而在高n(N)/n(P)比条件下，pH值升高对粒径及siRNA复合率的影响被高n(N)/n(P)掩盖，siRNA复合率及纳米粒粒径保持稳定(图3(a),(c))。Bc增大引起溶液离子强度增大而屏蔽壳聚糖及siRNA所携带电荷，静电作用减弱导致siRNA复合率大幅降低(图3(d))，同时壳聚糖分子内作用力减弱而致分子刚性增强，纳米粒粒径减小(图3(e))，测得的表面电位也因滑动层被压缩而显著降低[23, 26](图3(f))。

3结论

siRNA与阳离子聚合物的复合作为前述纳米粒传递过程的基础，对入胞、转运及siRNA释放过程皆有极其重要的影响，全面掌握制备条件对CS/siRNA复合特性的影响具有重要意义。CS/siRNA转染过程中，可以通过n(N)/n(P)比，Mw、DD及pH值、Bc调控得到siRNA复合率在90%以上，粒径100～300 nm，表面电位15～25 mV的纳米粒。不同表面性质及siRNA复合率的纳米粒将经历不同的入胞、转运路径及siRNA释放过程，即可以满足实际应用中的不同要求，从而更高效地将siRNA“转染”并“释放”于靶细胞的细胞质中并获得理想的基因沉默效果。

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Preparation and property characterization of chitosan/siRNA nanoparticles

ZHANG Demeng1,3, LOU Ruyun1,3,WANG Yu1,3,LIU Xiudong2,YU Weiting1,MA Xiaojun1

(1. Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China;2. College of Environment and Chemical Engineering, Dalian University, Dalian 116622, China;3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China)

Abstract:With the preparation of Chitosan/siRNA nanoparticles based on electrostatic self-assembly, a nucleic acid dye assay with SYBR® Gold was established to determine the condensation rate (CR) of siRNA in nanoparticles, and then the influence of n(N)/n(P) ratio, Mw, DD, pH and ion strength of chitosan solution on siRNA CR, nanoparticle size and zeta-potential was investigated by SYBR® Gold assay, dynamic light scattering and laser doppler electrophoresis respectively. The results showed that CR rose from (18.6±4.0)% to (92.9±2.0)% as n(N)/n(P) increased from 0.5 to 2 and stayed stable even when n(N)/n(P) reached 150. When n(N)/n(P) was below 2, no stable nanoparticles were detected and the complex was negative charged, while n(N)/n(P) went from 5 to 150, the size of nanoparticles increased from (179.3±5.7) nm to (235.5±8.3) nm and zeta-potential rose from (17.2±1.3) mV to (23.6±0.9) mV. At n(N)/n(P) 150, CR raised with the increase of DD or with the decrease of Bc, the size of nanoparticles increased with the increase of Mw and decreased with the increase of DD or Bc, the zeta-potential of nanoparticles increased with the increase of pH value or DD but decreased with the decrease of Bc. It demonstrated that n(N)/n(P) ratio is the most important factor determining the size, zeta-potential and CR, and nanoparticles with the diameter ranging from 100-300 nm and zeta-potential ranging from 15-25 mV can be easily obtained via adjusting above parameters.

Key words:chitosan; siRNA; nucleic acid dye; condensation rate

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.02.037

文献标识码：A

中图分类号：Q782

作者简介：张德蒙(1985-)，男，山东嘉祥人，博士生，师承马小军研究员，从事壳聚糖载siRNA纳米粒转运和释放性能研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(20876018)；辽宁省高等学校优秀科技人才支持计划资助项目(LR2013057)；辽宁省“十百千高端人才引进工程”启动基金资助项目(辽人社[2012]207号)

文章编号：1001-9731(2016)02-02188-05

收到初稿日期：2015-04-24 收到修改稿日期：2015-06-10 通讯作者：刘袖洞，E-mail: liuxd@dicp.ac.cn，于炜婷