胱氨酸钠改性TiO2薄膜及其抗血小板激活行为研究*
2016-05-17范永鸿韩鸿红潘夏鑫翁亚军
王 宏,范永鸿,韩鸿红,潘夏鑫,翁亚军,黄 楠
(1. 西南交通大学 生命科学与工程学院, 成都 610031;
2. 西南交通大学 材料科学与工程学院,材料先进技术教育部重点实验室, 成都 610031)
胱氨酸钠改性TiO2薄膜及其抗血小板激活行为研究*
王宏1,2,范永鸿2,韩鸿红2,潘夏鑫2,翁亚军2,黄楠2
(1. 西南交通大学 生命科学与工程学院, 成都 610031;
2. 西南交通大学 材料科学与工程学院,材料先进技术教育部重点实验室, 成都 610031)
摘要:生物材料表面固定催化活性分子,催化内源性供体释放一氧化氮(NO),能显著改善材料表面的血液相容性。通过聚多巴胺作为中间连接层,在TiO2薄膜表面固定不同手性的L-型或D-型胱氨酸钠获得催化活性表面,研究固定不同手性胱氨酸钠表面对改善血小板激活行为的影响。X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)和水接触角检测结果显示,在相同工艺条件下表面固定L-型或D-型胱氨酸钠后物理化学性质相近,而两种表面的生物学性质却存在较大差异,固定D-型表面预先吸附白蛋白后表面亲水性略有增加但标准偏差较大,而固定L-型表面催化释放NO的能力和抗血小板的激活性能均优于固定D-型表面。
关键词:TiO2薄膜;胱氨酸钠;手性;NO;血小板激活
0引言
无机TiO2薄膜具有抑制有毒金属离子释放和较好的抗凝血惰性等优点,在心血管材料表面改性研究领域引起了广泛的关注[1-2]。研究显示,通过进一步在TiO2薄膜表面接枝生物活性功能分子,可以显著提高其抗凝血性能或细胞相容性[3-4]。
一氧化氮(NO)是内皮细胞分泌的重要信号分子,释放NO的生物材料显示出优异的抗凝血和抗平滑肌增生性能。其中NO催化释放型材料将催化活性成分固定在材料表面,当与人体血浆接触时,由于人体中存在稳定的内源性NO供体,将催化产生NO[5-7]。例如,将含有二硫键的小分子胱胺固定在TiO2薄膜能够催化释放内源性NO供体释放NO,显著改善表面的抗血小板激活和粘附性能[8-10]。这类材料不受NO储存量的限制,具有较大的应用前景。本文选择胱氨酸钠作为催化活性分子,通过聚多巴胺作为中间连接层[11]将其固定在TiO2薄膜表面构建表面催化活性,原位催化内源性供体释放NO。
由于胱氨酸钠是手性分子,固定L-型和D-型胱氨酸钠的表面可能具有不同的生物学性能。生物体系中的蛋白质、糖类均具有手性特征,在药学研究领域已经证实不同手性特征的药物其生物学效能往往大不相同[12-13]。生物材料研究领域的研究结果也同样显示,表面成分相同,物理化学性质相似的表面,由于表面手性构型不同,显示出了不同的蛋白吸附能力和细胞相容性[14-15],因此本文拟开展固定L-型和D-型胱氨酸钠TiO2薄膜的抗血小板激活行为研究。
1实验
1.1胱氨酸钠改性TiO2薄膜的制备
采用UBMS450高真空非平衡磁控溅射设备,在单晶硅表面沉积TiO2薄膜,所制备的TiO2薄膜为锐钛矿晶型结构,标记为Ti-O。配制pH值=8.5的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液,加适量多巴胺溶解后使其浓度为2 mg/mL。37 ℃条件下将TiO2薄膜样品浸入上述多巴胺溶液中24 h,用蒸馏水超声清洗后得到沉积1层聚多巴胺的样品,重复上述操作4次得到沉积5层聚多巴胺层的样品,标记为Dop。配制6 mmol/L 的NaOH溶液,用此NaOH溶液分别溶解L-胱氨酸、D-胱氨酸(购自Sigma-aldrich公司)后制得终浓度为3 mmol/L的L-胱氨酸钠和D-胱氨酸钠溶液。将样品Dop分别浸泡在上述L-胱氨酸钠和D-胱氨酸钠溶液中反应24 h,清洗后得到表面接枝了L-胱氨酸钠或D-胱氨酸钠的样品,分别标记为L、D。
1.2XPS分析
XSAM800型X射线光电子能谱仪(英国KRATOS),分析条件为单色AlKα,工作电压10~20 kV,发射电流45 mA,光子能量为1 486.6 eV,以C1s(结合能EB=284.6 eV)校正结合能值。
1.3水接触角分析
用躺滴法测量样品表面的水接触角,测试仪器为DSA100型接触角测量仪(KRÜSS, Germany),结果为12个测试点的平均值。
表面吸附白蛋白后水接触角检测方法:配置0.5 mg/mL白蛋白溶液,将样品L、D分别浸入上述溶液中浸泡2 h,取出用蒸馏水清洗,真空干燥后用DSA100型接触角测量仪检测表面的亲水性。
1.4催化释放NO检测
采用Sievers 280i型NO化学发光检测仪(美国)检测样品催化释放NO。检测条件:N2作为载气,温度37 ℃,压强1 399.88 Pa,内源性供体溶液中GSH浓度为30 μmol/L,GSNO浓度为32.5 μmol/L,实验样品大小为0.8 cm×0.4 cm。
实验方法:将样品用细丝悬挂在玻璃反应器中,向反应器中加入内源性供体溶液,待基线稳定后将样品完全浸入溶液中,反应生成的NO通过N2气带入检测器进行检测。
1.5体外血小板粘附实验
由于体外实验会不断消耗内源性供体,而不能像体内那样自动补充,因此体外血小板实验时采取了添加内源性NO供体GSNO和GSH的方法。将样品置于24孔培养板中,每个样品上加入0.5 mL包含内源性供体的PRP,使内源性供体中GSNO浓度为65 μmol/L,GSH为30 μmol/L,37 ℃恒温水浴中避光孵化30 min。实验分为胶原组和非胶原组,胶原组中每个样品所在的24孔板中加入了胶原,其终浓度为0.06 mg/mL。
粘附血小板的荧光染色:用PBS清洗血小板粘附实验后的样品3次,避光条件下向每个样品表面滴加50 μL罗丹明荧光染料, 37 ℃避光保温15 min,然后用PBS洗去多余的荧光染料,晾干后用Leica荧光显微镜(Leica,Germany)进行拍照观察。
2结果与讨论
2.1XPS分析
图1所示为L-胱氨酸钠改性样品各层次的XPS检测结果。
图1固定L-胱氨酸钠各层次样品表面不同修饰层XPS图谱
Fig 1 XPS spectra of samples of each step modified by L-cystine (sodium salt)
从图1可知,相对于Ti-O样品,Dop样品表面出现了N1s的峰,说明多巴胺成功引入到氧化钛薄膜表面,而L样品表面相对Dop样品新出现了S2s(229 eV)和S2p(165 eV)峰,说明L-胱氨酸钠成功接枝到样品表面。固定D-胱氨酸钠系列样品的XPS全谱与L系列样品相似,因此不再赘述。
图2为固定不同手性胱氨酸钠样品上S元素的XPS高分辨图谱。通过样品L和D表面N、O、C和S各元素高分辨谱的峰面积积分和灵敏度因子,计算出样品L和D表面S元素的含量分别为1.4%和1.3%,表明在样品L和D表面固定的不同手性的胱氨酸钠含量几乎一致。
图2 样品L、D表面的S高分辨图谱
Fig 2 High resolution XPS spectra of sample L and sample D
2.2水接触角分析
图3为各样品的水接触角结果。样品上引入聚多巴胺后表面的水接触角明显降低,可能是聚多巴胺中含有大量的亲水性基团氨基和醌基的缘故。固定L-胱氨酸钠与D-胱氨酸钠样品表面的亲水性没有差别,然而吸附白蛋白后,两种表面的亲疏水性出现了明显的差别,D样品表面的亲水性略有增加,但多次实验结果显示D样品表面水接触角的标准偏差较大,说明D样品吸附白蛋白后表面的亲疏水性很不均匀,可能是D样品上吸附白蛋白的亲水区域和疏水区域暴露不均一所造成,深入的机制还需要进一步的研究。
图3 各样品的水接触角
2.3催化释放NO检测
化学发光方法检测NO释放的结果如图4所示。
图4样品L、D催化释放NO检测结果
Fig 4 Results of NO release catalyzed by sample L and sample D
待基线稳定后将样品浸入供体溶液中,结果显示固定了胱氨酸钠的样品均具有催化释放NO的功能。NO平稳释放,没有突释,图4中出现的尖峰是由拉下悬挂的样品时所造成的气体扰动所致。在供体溶液浓度和测试样品大小完全一致的条件下,结果显示L-型样品催化释放NO的速度明显增加。
2.4体外血小板粘附结果
胶原是血小板的激活剂,心血管器械在植入过程中难免会损伤内膜,暴露出下层胶原,因此本文考查了在胶原存在条件下,各样品表面血小板的粘附情况。结果如图5所示,胶原存在时表面粘附的血小板完全摊开,内容物释放,血小板激活程度最高,聚多巴胺表面由于具有醌基,因此具有一定的催化释放NO功能[16],其表面的血小板激活其次,样品L表面血小板的激活程度最低,血小板铺展最小。
图5 样品表面血小板粘附后的照片(胶原组)
未加胶原组血小板粘附后的照片(图6)也清楚地显示L样品表面粘附血小板的激活程度明显优于D样品上血小板的情况。
图6 样品表面体外血小板粘附后的照片(无胶原组)
3结论
(1)通过多巴胺过渡层成功将目标分子胱氨酸钠固定到TiO2薄膜表面,固定不同手性胱氨酸钠的表面S元素含量,表面亲水性相似,但预吸附白蛋白后表面的亲疏水性表现出明显不同,D-表面亲水性略有增加但不均匀。
(2)固定胱氨酸钠的表面能够催化内源性供体GSNO释放NO,而固定L型胱氨酸钠的表面相对D-型表面具有更大的催化活性。
(3)固定胱氨酸钠的样品通过催化释放NO,显著抑制了胶原对血小板的激活,固定L-胱氨酸钠的样品具有更强的抑制血小板激活功能。
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Study of cystine sodium immobilization and anti-platelet activation on TiO2film
WANG Hong1,2, FAN Yonghong2, HAN Honghong2, PAN Xiaxin2,WENG Yajun2, HUANG Nan2
(1.School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China;2.Key Laboratory for Advanced Technologies of Materials, Ministry of Education,School of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China)
Abstract:It is acknowledged that NO releasing by degradation of endogenous NO donor catalyzed by biomaterials can significantly improve blood compatibility of the surfaces. And D-cystinesodium, a poly-dopamine coating was used to as a linker to immobilize cystine sodium with different chirality such as L-cystinesodium on TiO2 films to construct catalytic activity. The effect of immobilizing cystine sodium with different chirality on anti-platelet activation was analyzed. The X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and the water contact angle test results showed that, in the same preparation process, the surfaces with either L-cystinesodium or D-cystinesodium immobilization have similar physical and chemical properties, while there are different biological properties of the two kinds of thesurfaces.Surfaces with D-cysteine sodium immobilization show higher hydrophilicproperties with higher standard error after pre-adsorption of BSA, while surfaces with L-type immobilization show higher NO release by catalyzing endogenous NO and enhancement of anti-platelet activation ability in vitro.
Key words:TiO2 films; cystine sodium; chirality; nitric oxide; platelet adhesion
DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.02.002
文献标识码:A
中图分类号:R318.08
作者简介:王宏(1989-),女,山东烟台人,硕士,师承翁亚军副教授和黄楠教授,从事生物材料表面功能化研究。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(31270020);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(2682014CX006);四川省青年基金资助项目(2013JQ0043)
文章编号:1001-9731(2016)02-02006-04
收到初稿日期:2015-02-24 收到修改稿日期:2015-06-19 通讯作者:翁亚军,E-mail:wengyj7032@swjtu.edu.cn