纳米锶羟基磷灰石的制备及对甲氨蝶呤吸附性能的研究*

谢袁菲，季金苟，向存程，徐　溢

(重庆大学 化学化工学院，重庆 400030)



纳米锶羟基磷灰石的制备及对甲氨蝶呤吸附性能的研究*

谢袁菲，季金苟，向存程，徐溢

(重庆大学 化学化工学院，重庆 400030)

摘要：为了制备具有较高甲氨蝶呤(MTX)吸附性能的药物载体用于骨肿瘤治疗，用共沉淀法制备不同掺锶量的纳米锶羟基磷灰石(nano-SrHA)，利用XRD、TEM等对其进行了表征，并考察了共沉淀时间、掺锶比、甲氨蝶呤(MTX)浓度、溶液pH值等对吸附MTX性能的影响。结果表明，掺锶比对nano-SrHA的大小及形状都有一定影响，随着掺锶比的增加，晶体尺寸变小；掺锶比影响nano-SrHA对MTX吸收，不同掺锶比中nano-Sr(0.3)HA对MTX的吸附效果最佳；共沉淀反应时间增加有利于晶型的锐化和吸附性能的提高；pH值为7.8的弱碱环境有助于nano-Sr(0.3)HA吸附MTX，最大吸附量高达43.09 mg/g。nano-Sr(0.3)HA是一种良好的MTX吸附载体。

关键词：纳米锶羟基磷灰石；吸附性能；甲氨蝶呤

0引言

炎症、肿瘤等常会引起骨组织的缺损，不仅造成畸变，还会引起一系列的功能障碍。纳米羟基磷灰石[nano-Ca10(PO4)6(OH)2, nano-HA]是众多磷酸钙化合物的一种，其化学组分和晶型结构类似人体自然骨，表现出较好的生物相容性、生物可降解性、生物稳定性、吸附载药性、引导骨生长、无毒性等生物活性[1-3]。nano-HA因其较大的比表面积和表面活性，能吸附和传递蛋白质、多肽类、免疫调节剂、疫苗等药物[4]，可有效地提高药物的通透性而发挥药效，故被广泛地应用于骨损伤方面的治疗[5-7]。nano-HA中的OH-与2个Ca2+连接，当晶体表面的OH-位置在某一时刻空缺时，使得HA晶体表面带有由Ca2+引起的多余的正电荷而形成较强的吸附位点(C点)，这个位点能够吸附大分子上的磷酸基团或是羧基基团[8]。锶是人体内必需微量元素之一，在骨内的含量约为0.01%，远低于钙含量。大量实验表明，纳米锶羟基磷灰石[nano-CaxSry(PO4)6(OH)2, nano-SrHA,x+y=10]比nano-HA具有更好的生物性能，锶的掺入改变了载体材料的结晶性和生物降解性，提高骨容量，减少骨流失，诱导成骨细胞活性，促进成骨细胞的增殖与分化，抑制破骨细胞活性，增强骨强度和更好地吸附蛋白质、脂质、氨基酸及骨肿瘤治疗药物[9]。

本文以共沉淀法制备了不同掺锶比的nano-SrHA，并对其进行表征，以含羧基的抗肿瘤药物甲氨蝶呤(Methotreaxate, MTX)为模型药物，考察了nano-SrHA对MTX的吸附性能，以期找到一个较好的抗骨肿瘤药物载体。

1实验

1.1 试剂与仪器

MTX(陕西顶点医药化工有限公司)、硝酸钙、氯化锶、磷酸氢二铵、氨水、氢氧化钠等其余试剂均为国产分析纯。

T6-新世纪紫外分光光度计(北京普析通用有限责任公司)；Shimadzu XRD6000X射线衍射仪(XRD，日本Shimadzu制作所)；HITACHI-600透射电镜(TEM，日本日立公司)；85-2数显恒温磁力搅拌器(江苏省金坛市中正仪器制造有限公司)；KQ-2200B超声清洗器(巩义市予华仪器有限责任公司)；FD-1冷冻干燥机(北京德天佑科技发展有限公司)等。

1.2nano-SrHA的制备

采用共沉淀法制备nano-SrHA[10]。在伴有搅拌和回流的三颈瓶中，加入计量好的硝酸钙和氯化锶溶液，用1∶2的氨水调节溶液pH值=10，在油浴中加热至60 ℃。另量取相应的磷酸氢二铵溶液，事先用1∶1的氨水调节pH值=10，转入滴液漏斗，以每分钟2～5 mL的速度滴入三颈瓶中。滴加过程中用1∶2的氨水调节溶液pH值=10。于80 ℃下反应3 h，加热沸腾1 h，室温陈化(静置过夜)，制得nano-SrHAP。过滤，沉淀物用去离子水多次洗涤至pH值=7，沉淀冷冻干燥，制备含不同掺锶比的nano-SrHA。

1.3nano-SrHA晶型及表面形貌表征

用XRD进行晶型分析，扫描2θ角为10～60°；另取少量样品于 50 mL蒸馏水中，超声分散后滴到铜网上，用磷钨酸染色，室温干燥，再用TEM观察表面形貌。

1.4检测波长的选择

配制一定浓度的MTX溶液，用紫外-可见光200～600 nm扫描，确定MTX最大吸收波长。

1.5MTX标准曲线的绘制

配制0.25 mg/mL的MTX储备液，分别吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9和1.0 mL储备液置于10 mL容量瓶中，加0.01 mol/L的NaOH溶液定容，摇匀，即得MTX标准溶液。以0.01 mol/L的NaOH溶液为参比，在MTX最大吸收波长处测定其吸光度，重复3次，取平均值。

1.6载药nano-SrHA的制备及药物吸附量的测定

采用吸附-冷冻干燥法制备载药nano-SrHA[11]。分别称取一定量的不同掺锶比的nano-SrHA粉体于适量药物浓度的溶液中，超声30 min，再恒温振荡吸附一定时间，过滤，用去离子水洗涤沉淀，去掉表面粘附的药物，冷冻干燥沉淀，即得载药nano-SrHA。滤液稀释，于MTX最大吸收波长处测定其吸光度，换算成浓度，按下式计算药物的吸附量

式中，q表示每克nano-SrHA吸附药物的量，mg/g；C0为溶液中药物的初始浓度，μg/mL；CV为吸附后残留药物浓度，μg/mL；m为nano-SrHA的质量，g；V为吸附液体积，mL。

考察掺锶比、共沉淀时间、药物浓度、溶液pH值对nano-SrHA吸附MTX性能的影响。

2结果与讨论

2.1掺锶比对nano-SrHA晶型的影响

图1为不同掺锶比的nano-SrHA XRD图，从图中可以看出，2θ在25.8°(002)、31.7°(211)、32.2°(112)分别出现强的特征衍射峰。nano-HA的XRD谱与HA标准卡片(ICSD 09-0432)中的数据吻合，nano-HSr的XRD谱与HSr标准卡片(ICSD 33-1348)中的数据吻合，其余nano-SrHA(Sr/[Sr+Ca]=0.3～0.7)的XRD谱分别与34-0482、34-0479、34-0478中数据相对应。由此可以推断所制备的产物为nano-HA、nano-HSr及nano-SrHA(Sr/[Sr+Ca]=0.3～0.7)。

图1Nano-HA、不同掺锶比nano-SrHA、nano-HSr 的XRD图

Fig 1 XRD patterns of nano-HA, nano-SrHA with different Sr ratios and nano-HSr

从图1还可以看出，随着掺锶比的增加，(002)晶面与(211)晶面衍射峰逐渐向小角度偏移，这和Bragg 公式λ=2dsinθ是相一致的，由于Sr2+半径大于Ca2+(Sr2+、 Ca2+半径分别为0.113和0.099 nm)，使得晶格常数变大、晶面间距d增大，当X射线波长λ一定时，衍射角2θ向小角偏移。

本文发现，随着掺锶比的增加，(211)晶面与(002)晶面峰面积之比随之增加，R2=0.98914(见表1)。这可以推测，随着掺锶比的增加，nano-SrHA沿c轴(002)晶面方向生长趋势逐渐弱化。

表1(211)晶面与(002)晶面峰面积

Table 1 Peak area of (211) and (002)

Sr/[Sr+Ca]原子比S(002)S(211)S(211)/S(002)0.0334295862.870.34248169433.990.53396190085.600.72425210798.691.020133411816.95

2.2共沉淀时间对nano-SrHA晶型的影响

表2为共沉淀时间对nano-Sr0.3HA (211)晶面间距和峰高的影响，由表2可以发现随着共沉淀时间的增加，nano-Sr0.3HA (211)晶面间距和峰高逐渐增大。根据布拉维法则可知，随着(211)晶面间距d的增大，晶面的结点密度增大，相邻晶面间引起减小，晶体成长逐渐变缓，并于3 h后趋于稳定。一般认为峰高是由同方向排列的晶面分布数量决定的，(211)晶面峰高随共沉淀时间增加而增大，说明其晶面增多，晶体结晶度提高，且3 h后晶体生长已基本稳定。

表2共沉淀时间对nano-Sr0.3HA 晶型的影响

Table 2 Effect of coprecipitation time on the crystal forms of nano-Sr0.3HA

Coprecipitationtime/h2θdHeight0.531.4782.83970.671.031.3812.84822.571.531.3412.85183.632.031.3202.85374.102.531.2992.85564.483.031.2822.85714.843.531.2772.85754.984.031.2792.85745.10

2.3掺锶对nano-SrHA粒径的影响

图2分别为nano-HA(a)、nano-Sr0.3HA(b)和nano-HSr(c)的TEM图。从图2可以看出，nano-HA为针条状，nano-Sr0.3HA为短针状， nano-HSr为短棒状，其对应尺寸分别约为Ø25 nm×130 nm、Ø20 nm×100 nm和Ø15 nm×70 nm。这可能和nano-HA沿c轴(002)方向有较强的生长趋势有关(见表1)，随着掺锶比增加，沿c轴(002)方向生长趋势减弱，导致晶体尺寸变小。

图2Nano-HA、nano-Sr0.3HA、nano-HSr的TEM图

Fig 2 Transmission Electron Microscope of nano-HA, nano-Sr0.3HA, nano-HSr

2.4掺锶比对nano-SrHA吸附MTX性能的影响

图3为掺锶比对nano-SrHA吸附性能的影响。

图3　掺锶比对nano-SrHA吸附性能的影响

Fig 3 Ratios of Sr on absorption quantity of nano-SrHA

由图3可以看出，nano-SrHA对MTX吸附性能的大小顺序为nano-Sr0.3HA>nano-Sr0.5HA>nano-Sr0.7HA>nano-HA>nano-HSr。nano-SrHA对MTX的吸附能力可能是由两方面的原因所决定：(1)不同离子对MTX的结合力不同所致，Ca2+离子的半径小，其对MTX的结合力要大于Sr2+对MTX的结合力，故nano-HA > nano-HSr；(2)晶格应力不同导致其对MTX的吸收不同，掺Sr2+后的晶体，其晶格应力要大于纯的nano-HA和nano-HSr，对MTX的吸附能力增强，故nano-Sr0.3HA> nano-HA。综合考虑以上两个因素，最终导致它们对MTX吸附的能力为nano-Sr0.3HA> nano-Sr0.5HA>nano-Sr0.7HA>nano-HA >nano-HSr。

2.5共沉淀时间对nano-SrHA吸附MTX性能的影响

图4为制备nano-Sr0.3HA共沉淀时间对吸附MTX性能的影响。从图4可以发现，nano-Sr0.3HA吸附MTX的量随其制备时的共沉淀时间的增加而增加，3 h后均基本不变。这可能是因为在共沉淀法制备nano-Sr0.3HA时，率先形成的缺钙(或锶)HA，导致其对MTX的吸附位点较减少，随着共沉淀反应的时间增长，正离子的位点逐渐被填补，吸附MTX量也逐渐增加。共沉淀3 h后，nano-CaxSry(PO4)6(OH)2中[x+y]/6基本达到1.67，形成了较完整的nano-Sr0.3HA晶型，故吸附量不再增加，这和图3的现象是基本一致的。

图4　共沉淀时间对吸附MTX性能的影响

Fig 4 Effect of coprecipitation time of on the absorption quantity

2.6MTX浓度对nano-SrHA吸附性能的影响

图5为溶液pH值=8.8时， MTX浓度对nano-Sr0.3HA吸附性能的影响。

图5　MTX浓度对nano-Sr0.3HA吸附性能的影响

Fig 5 Effect of MTX concentrations on absorption quantity of nano-Sr0.3HA

由图5可知，随着MTX浓度的增加，nano-Sr0.3HA的吸附量随之增加。当MTX为62.40 μg/mL时吸附量趋于饱和，此时nano-Sr0.3HA最大吸附量为40.27 mg/g。

2.7pH值对nano-SrHA吸附MTX性能的影响

图6为pH值对nano-Sr0.3HA吸附性能的影响。从图6可以看出，在pH值=7.8附近的吸附量最大，为43.09 mg/g，过酸或过碱使得吸附量减少。这可能与MTX的pka值及溶液pH值对nano-Sr0.3HA吸附位点的影响有关。如图7所示，MTX上α位的羧基pka=4.7，β位的羧基pka=3.4[12]。在较低pH值环境中，MTX上的H+解离有限，因此较难被nano-Sr0.3HA吸附位点(Ca2+或Sr2+)吸附；随着溶液pH值的升高，H+解离增加，从而使MTX呈现负电荷形式增多，nano-Sr0.3HA对其吸附增加。然而当碱性过强时，Sr2+、Ca2+所带来的吸附位点可能会优先吸附富余的OH-，使得nano-Sr0.3HA吸附MTX的能力下降。

图6　pH值对nano-Sr0.3HA吸附性能的影响

Fig 6 Effect of pH on the absorption of nano-Sr0.3HA

图7　甲氨蝶呤结构式

3结论

(1)Nano-HA呈短针状，尺寸约Ø25 nm×130 nm，锶的掺入抑制了晶体沿c轴方向的生长趋势，致使其晶体尺寸变小。

(2)随着共沉淀时间的增加，nano-SrHA晶型逐渐锐化，对MTX的吸附量随之增加，3 h后基本不变。

(3)由于Sr的掺入，晶体应力发生改变，nano-SrHA对MTX的吸附不仅与钙离子相对量有关，也与应力有关，最终导致nano-Sr0.3HA对MTX的吸附效果最佳。

(4)弱碱环境有助于提高nano-SrHA吸附MTX性能，当pH值为7.8时，nano-Sr0.3HA对MTX吸附可达到43.09 mg/g。

综上所述，nano-Sr0.3HA对含羧基抗肿瘤药物具有良好的吸附性能，有望成为骨肿瘤治疗的良好的药物载体。

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Preparation and absorption capability study of strontium substituted nano-hydroxyapatite for methotreaxate

XIE Yuanfei，JI Jingou，XIANG Cuncheng，XU Yi

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China)

Abstract:Strontium substituted nano-hydroxyapatite (nano-SrHA) was synthesized by co-precipitation method and applied to treat bone tumors.. The morphology of nano-SrHA was determined by transmission electron microscope (TEM) while its phase composition was characterized with X-ray diffraction (XRD). The absorption capability of nano-SrHA effected by coprecipitation time, feeding ratios of Sr, methotreaxate (MTX) concentrations and pH were also investigated. The results showed that the diffraction angles of nano-SrHA shifted to small value with the increase of feeding ratios of Sr, crystal forms and absorption capability increased with the coprecipitation time, and the nano-Sr(0.3)HA with the acicular structure had the best absorption capability of 43.09 mg/g when the pH was about 7.8. It indicated that nano-Sr(0.3)HA might be a potential candidate as MTX-delivery carrier.

Key words:nano-SrHA;absorption capability;methotreaxate

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.02.007

文献标识码：A

中图分类号：O614.23+2; R318.08

作者简介：谢袁菲(1989-)，女，重庆人，在读硕士，师承季金苟教授，从事纳米材料研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(21375156)

文章编号：1001-9731(2016)02-02031-05

收到初稿日期：2015-03-10 收到修改稿日期：2015-10-21 通讯作者：季金苟，E-mail: 725_tiger@sina.com