自发性癫痫大鼠皮质和海马中GLT-1、EAAC-1表达

2016-05-16邹显巍刘爱东余建萍

神经损伤与功能重建 2016年4期

邹显巍，刘爱东，余建萍

邹显巍，刘爱东，余建萍

目的：研究自发性癫痫大鼠皮质、海马中谷氨酸转运体-1（GLT-1）、兴奋性氨基酸载体-1（EAAC-1）的转录、表达水平及其意义。方法：选取自发性癫痫Wistar大鼠（癫痫组）和正常Wistar大鼠（正常组）各10只，采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测2组大鼠皮质、海马中GLT-1、EAAC1 mRNA转录水平，采用蛋白质印迹技术检测2组大鼠皮质、海马中GLT-1、EAAC-1蛋白的表达水平。结果：癫痫组大鼠皮质中EAAC-1 mRNA相对灰度值为（0.67±0.21），明显低于正常组大鼠的（1.54±0.38）（P＜0.01）；2组大鼠皮质中GLT-1 mRNA和海马中GLT-1 mRNA、EAAC-1 mRNA相对灰度值差异无统计学意义（P＞0.05）。癫痫组大鼠皮质中EAAC-1、GLT-1蛋白表达水平的相对灰度值分别为（72.6±8.7）和（103.7±12.6），显著低于正常组大鼠的（116.5±15.1）和（139.5±14.2）（P＜0.01）；癫痫组大鼠海马中GLT-1蛋白表达水平的相对灰度值（196.7± 23.5）明显的高于正常组大鼠的（145.5±19.7）（P＜0.01）；2组大鼠海马中EAAC-1蛋白表达水平的相对灰度值差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：自发性癫痫大鼠皮质中GLT-1、EAAC-1表达水平下调可能与癫痫发生有关。

自发性癫痫大鼠；皮质；海马；谷氨酸转运体-1；兴奋性氨基酸载体-1

癫痫是大脑神经元异常放电引起大脑功能短暂失常的慢性脑部疾病[1]，其发作机制复杂多变，主要包括遗传因素、脑部疾病等。有研究报道约42%的患者是遗传因素导致癫痫发作[2]。在遗传因素中，谷氨酸和其他氨基酸转运功能的改变是其中重要的方面[3]。本文主要研究自发性癫痫大鼠皮质、海马中谷氨酸转运体-1（glutamate transporter-1，GLT-1）、兴奋性氨基酸载体-1（excitatory amino-acid carrier 1，EAAC-1）的表达水平及其意义，探讨其在代谢遗传性癫痫的发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物选取选取自发性癫痫Wistar大鼠（癫痫组）和正常Wistar大鼠（正常组）各10只，雌雄各半，周龄11～13周，平均（12.3±0.4）周，体质量 260～320g，平均（289.4±18.6）g，自发性癫痫大鼠购买自中国医科大学动物试验部（合格证号2014009），所有大鼠生活在光照12 h、湿度40%～60%、温度23℃～25℃的环境中，自由进食进水。

1.1.2 主要试剂与材料甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、EAAC-1、GLT-1引物均由TaKaRa公司合成；免疫组化SP试剂盒，DAB显色试剂盒购于美国Santa Cruz公司；兔抗鼠EAAC-l、β-actin、GLT-1多克隆抗体购于美国Abcam公司；GDS-8000型凝胶成像系统购于德国Eppendoff公司；DYY-5型稳流稳压电泳仪购于山东六一仪器；PCR扩增仪购于美国Amersham Bioseiences公司；垂直电泳、印迹系统购于美国Biometra公司；低温高速离心机购于英国UVP公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 检测2组大鼠（正常组为4只大鼠，癫痫组为5只大鼠）皮质、海马中GLT-1、EAAC1 mRNA转录水平。RNA提取：麻醉状态下将大鼠断头，取出双侧皮质和海马，使用TaKaRa RT-PCR试剂盒提取皮质和海马的总RNA。RT反应体系：37°C 1.5 h，94°C 5～10 min，反应体积为10 μL。PCR反应体系：94°C预变性2 min，94°C 45 s，55°C 40 s，72°C 1 min，共30个循环，72°C延伸10 min，反应体积为50 μL，设空白对照。反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后经电泳凝胶成像分析系统采集图像，测定灰度值[4]。

1.2.2 Western blotting 检测2组大鼠（2组各3只大鼠）皮质、海马中GLT-1、EAAC-1蛋白的表达水平。蛋白样品收集：大鼠麻醉状态下断头迅速取皮质和海马，加l mL裂解液，匀浆后4℃条件下12 000 g离心40 min，倾倒上清液，加入0.5 mL loading buffer，直接上样。电泳：所有蛋白样品调至等浓度后上样电泳（10%SDSPAGE凝胶），电压120 V。转膜：将PVDF膜在M-OH中浸泡20 min以上，之后将PVDF膜并滤纸转入转移液中。封闭及杂交：将膜取出，用去离子水与TTBS稍加漂洗，在含5%脱脂奶粉的TTBS封闭液与抗体溶剂中室温封闭1.5 h，加入一抗（1∶600）室温下3 h，再用TTBS漂洗膜后再浸洗3次，最后加入相应的二抗（1∶5 000）室温下2 h，再用TTBS漂洗膜后再浸洗3次。发光鉴定：ECL化学发光法显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪采集，测定灰度值[5]。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 2组大鼠皮质、海马中GLT-1、EAAC-1 mRNA转录水平比较

癫痫组大鼠皮质中EAAC-1 mRNA相对灰度值为（0.67±0.21），明显低于正常组大鼠的（1.54±0.38），有显著性差异（P＜0.01）；2组大鼠皮质中GLT-1 mRNA的转录水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表1、图1。2组大鼠海马中GLT-1 mRNA、EAAC-1 mRNA相对灰度值差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 2组大鼠皮质、海马中GLT-1、EAAC-1 mRNA相对灰度值比较（）

组别只数皮质GLT-1EAAC-1海马GLT-1EAAC-1正常组癫痫组t值P值10 10 1.20±0.33 1.14±0.28 0.438 0.718 1.54±0.38 0.67±0.21 6.337＜0.001 1.10±0.26 1.03±0.25 0.614 0.539 1.27±0.34 1.22±0.29 0.354 0.796

图1 RT-PCR法检测2组大鼠皮质EAAC-1 mRNA转录水平

2.2 2组大鼠皮质、海马中GLT-1、EAAC-1蛋白表达水平比较

Western blotting检测结果显示，癫痫组大鼠皮质中EAAC-1、GLT-1蛋白表达水平的相对灰度值分别为（72.6±8.7）及（103.7±12.6），明显低于正常组大鼠的（116.5±15.1）及（139.5±14.2），有显著性差异（P＜0.01）；癫痫组大鼠海马中GLT-1蛋白表达水平的相对灰度值（196.7±23.5），明显高于正常组大鼠的（145.5±19.7），有显著性差异（P＜0.01）；2组大鼠海马中EAAC-1蛋白表达水平的相对灰度值差异无统计学意义（P＞0.05），见表2、图2。

3 讨论

癫痫长时间频繁的发作会对患者身心各方面造成严重影响[6]，其发病机制尚不完全清楚，部分分子遗传学研究发现遗传性癫痫的分子机制为离子通道或相关分子的结构或功能改变[7]。进一步研究发现，多种癫痫动物模型和癫痫患者的脑组织突触间隙内谷氨酸浓度明显增加[8,9]。谷氨酸是脑内最重要的兴奋性氨基酸，谷氨酸转运体能将谷氨酸从突触间隙清除，且具有唯一性。谷氨酸转运体包括GLT-1、EAAC-l等。GLT-1为胶质细胞型转运体，EAAC-l为神经元型转运体，前者在大脑皮质和海马中表达最为丰富，能吸收超过90%的谷氨酸；后者主要在各脑区的神经元中表达，能降低突触间隙谷氨酸浓度[10]。研究发现若小鼠敲除GLT-1基因会发生致命性自发性癫痫[11]，成年大鼠海马EAAC-l被反义下调时会表现出与癫痫小发作相似的现象，但具体原因还需进一步探究。因此本课题主要研究了自发性癫痫大鼠皮质、海马中GLT-1和EAAC-1的转录、表达水平及其意义。

表2 2组大鼠皮质、海马中GLT-1、EAAC-1蛋白表达水平相对灰度值比较（）

组别只数正常组癫痫组t值P值10 10皮质GLT-1 139.5±14.2 103.7±12.6 5.963＜0.001 EAAC-1 116.5±15.1 72.6±8.7 6.913＜0.001海马GLT-1 145.5±19.7 196.7±23.5 5.280＜0.001 EAAC-1 164.0±19.8 169.3±21.5 1.006 0.251

图2 2组皮质（A）及海马（B）中GLT-1、EAAC-1蛋白表达水平的Western blotting检测结果

本实验通过对癫痫组大鼠与正常组大鼠皮质、海马中GLT-1、EAAC-1 mRNA和蛋白的转录、表达水平进行比较，结果显示，皮质中EAAC-1 mRNA和EAAC-1蛋白表达水平均显著下调，转录和翻译有很好的相关性，与其他相关研究结果类似[12]。推测可能是EAAC-l表达下调打破抑制性和兴奋性氨基酸系统之间的平衡，促进癫痫发生。本研究显示海马中GLT-1 mRNA转录水平没有改变，但GLT-1蛋白表达显著上调。

综上所述，该遗传性癫痫模型的发病机制之一可能与皮质中EAAC-1、GLT-1 mRNA和蛋白表达下调有关。而致使分子学机制异常的根本原因以及能否利对谷氨酸转运体的药物以达到治疗癫痫一步研究。

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（本文编辑：唐颖馨）

Expression of EAAC-1 and GLT-1 in Cortex and Hippocampus of Rats with Spontaneous Epi-lepsy

ZOU Xian-wei,LIU Ai-dong,YU Jian-ping.Department of Internal Medicine-Neurology,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610500,China

Objective:To investigate the expression of glutamate transporter-1(GLT-1)and excitatory amino acid transporter-1(EAAC-1)in cortex and hippocampus of spontaneous epileptic rats.Methods:Wistar rats were divided into epilepsy group and normal group with 10 rats in each group.The transcription levels of GLT-1 and EAAC-1 mRNA in cortex and hippocampus were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).The expression levels of EAAC-1 and GLT-1 protein was detected by Western blot analysis.Results: The transcription level of EAAC-1 mRNA in cortex of epilepsy group was(0.67±0.21),which was significantly lower than that of control group(P＜0.05).No difference was observed in the transcription level of GLT-1 mRNA in cortex and the levels of GLT-1 mRNA and EAAC-1 mRNA in hippocampus between 2 groups(P＞0.05).The expression levels of EAAC-1 and GLT-1 protein in cortex of epilepsy group were(72.6±8.7)and(103.7±12.6), which were significantly lower than those in control group(P＜0.01).The expression level of GLT-1 protein in hippocampus of epilepsy group was(196.7±23.5),which was significantly higher than that of control group(P＜0.01).No difference was shown in the transcription levels of EAAC-1 protein in hippocampus between 2 groups (P＞0.05).Conclusion:The down-regulation of GLT-1 and EAAC-1 expression in cortex may be involved in the occurrence of epilepsy in rats with spontaneous seizures.

spontaneous epileptic rat;cortex;hippocampus;glutamate transporter-1;excitatory amino acid car-

R741;R742.1

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.04.003

成都医学院第一附属医院神经内科成都 610500

2015-10-16

邹显巍3188902437@qq. com