158株耐多药结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药及相关基因突变情况研究

王前 宋媛媛 王玉峰 逄宇 赵雁林



158株耐多药结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药及相关基因突变情况研究

王前 宋媛媛 王玉峰 逄宇 赵雁林

目的 分析我国耐多药结核分枝杆菌菌株对利奈唑胺的耐药率，探究结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药相关基因的突变特征。 方法 作者于2013年10月采用直接抽选法，从401株来自于2007年全国结核病耐药性基线调查的耐多药结核分枝杆菌菌株中随机抽取158株，分为耐多药组(107/158,67.7%)、前广泛耐药组(41/158,26.0%)和广泛耐药组(10/158,6.3%)；采用微孔板稀释法检测其对利奈唑胺的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentrataion，MIC)，以结核分枝杆菌标准株H37Rv (ATCC 27249)作为对照，当MIC高于临界浓度时，判定为结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药。同时对利奈唑胺耐药的结核分枝杆菌相关基因23SrRNA、rplC和rplD进行测序，分析其突变特征；采用Fisher确切概率法及卡方检验统计不同组别间利奈唑胺耐药率的差别，以P<0.05为差异有统计学意义。结果 158株耐多药菌株对利奈唑胺的总耐药率为10.8%(17/158)。其中10株广泛耐药菌株中有6株对利奈唑胺耐药(6/10)，明显高于耐多药组(5.6%,6/107)和前广泛耐药组(12.2%，5/41)，经Fisher确切概率法检验差异均有统计学意义(P<0.001；P=0.004)。在17株利奈唑胺耐药菌株中，共发现5株(29.4%)在23SrRNA或(和)rplC基因发生突变，同时首次鉴定到rplC基因His155Asp突变可能与低水平利奈唑胺耐药(MIC=2 μg/ml)相关。结论 广泛耐多药结核分枝杆菌对利奈唑胺的耐药率明显高于耐多药和前广泛耐药结核分枝杆菌；23SrRNA和rplC基因突变可能与利奈唑胺耐药性相关。

分枝杆菌，结核； 恶唑烷酮类； 利奈唑胺； 结核, 抗多种药物性； 基因, 细菌； 突变； 因果律

结核病是全世界面临的公共卫生问题[1]。虽然得益于抗结核药物的问世，全世界结核病发病率呈逐年下降趋势，耐多药(multi-drug resistance，MDR)、特别是广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB)已成为结核病防控工作面临的新挑战[2]。我国是全球耐药结核病高负担国家之一，特别是MDR和XDR的发病率居高不下[3]。据全国结核病耐药基线调查结果显示，我国每年约发生110 000例MDR及8200例XDR患者，已成为我国临床及公共卫生领域面临的巨大威胁[2]。MDR患者治疗通常需要二线抗结核药物，但在完成全部疗程后其治愈率仅为50%，因此迫切需要新的抗结核药物补充现有治疗方案[4]。利奈唑胺是恶唑烷酮类抗生素,体外试验及动物实验表明，利奈唑胺对MDR和XDR表现出良好的抑菌活性[5]。虽然利奈唑胺价格较高且存在不良反应，但多项病例报道和临床回顾性研究表明，利奈唑胺能够明显提高MDR和XDR患者的治愈率[6-7]。因此，有必要在MDR患者中开展关于利奈唑胺耐药率的流行病学研究；然而，目前对利奈唑胺耐药率和耐药机制等方面的研究甚少。本研究采用简单随机抽样法中的直接抽选法抽取来自于全国耐药基线调查的耐多药结核分枝杆菌菌株，采用微孔板稀释法检测菌株对利奈唑胺的耐药情况，同时，对利奈唑胺耐药相关基因进行测序分析。

材料和方法

一、菌株来源

于2013年10月采用简单随机抽样法中的直接抽选法从401株来自于2007年全国结核病耐药性基线调查的耐多药结核分枝杆菌菌株中抽取158株，菌株由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供[2]，其各省来源如表1所示。上述菌株经过传统比例法[2]药物敏感性试验(简称“药敏试验”)鉴定对利福平和异烟肼两种药物同时耐药；同时采用对硝苯甲酸(PNB)和噻吩二羧酸肼(TCH)菌种鉴定试验[2]证实是结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)。标准菌株H37Rv为国家结核病参比实验室保藏菌株。

表1 菌株来源表

二、菌株分组

158株耐多药结核分枝杆菌传统药敏试验鉴定分为3组，分别为耐多药组(107/158,67.7%)、广泛耐药组(41/158,26.0%)和前广泛耐药组(10/158,6.3%)。

三、相关定义

1.耐多药结核分枝杆菌：至少同时对异烟肼和利福平耐药的结核分枝杆菌菌株。

2.前广泛耐药(pre-XDR)：对任何氟喹诺酮类药物或者3种二线注射药物(卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中的至少1种耐药，但不同时对氟喹诺酮和任一二线注射类药物耐药的耐多药结核分枝杆菌。

3.广泛耐药(XDR)：对任何氟喹诺酮类药物及3种二线注射药物(卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中的至少1种耐药的耐多药结核分枝杆菌[8]。

4.全敏感菌株：对所有被检测抗结核药物均表现为敏感的结核分枝杆菌。

5.最低抑菌浓度(MIC)：能抑制结核分枝杆菌生长的最低药物浓度。MIC50是指在一批实验中能抑制50%受试菌所需的最低抑菌浓度；MIC90是指是指在一批实验中能抑制90%受试菌所需的最低抑菌浓度[9]。

6.工作浓度：用于检测结核分枝杆菌体外药敏试验时培养基中药物浓度。

7.靶标基因：结核分枝杆菌细胞内被药物作用的蛋白质称为靶标，编码靶标蛋白的基因被称为靶标基因。

8.天然耐药机制：由于不同的细菌细胞结构与化学组成等不同,使其本身对某些抗生素天然不敏感的机制。

四、试剂来源

本试验所用改良罗氏培养基购自珠海贝索生物有限公司；7H9培养基和OADC添加剂购自于美国碧迪生物公司；Alamar blue购自于美国伯乐生物公司；2×Taq预混液购自于北京康为世纪生物科技有限公司；所有引物均由北京擎科生物技术有限公司合成。

五、MIC测定及判定标准

选用微孔板Alamar蓝(Alamar blue)显色法进行检测[10]。刮取改良中性罗氏培养基上生长4周的新鲜菌落，使用磨菌瓶磨菌，使用比浊仪将菌液稀释到1个麦氏浓度，再以1∶20稀释后向96孔微孔板加入100 μl 菌液。微孔板静置于37 ℃培养箱中孵育7 d，向实验微孔中加入70 μl 预混的显色液(含20 μl Alamar blue和50 μl 5.0% Tween-80)，37 ℃孵育24 h 后观察各孔颜色，蓝色孔为无结核分枝杆菌生长，红色孔为有生长。从蓝色孔结果可以得出能抑制结核分枝杆菌生长的MIC。利奈唑胺在微孔板中设置的工作浓度分别为0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32和64 μg/ml。根据文献[11]，确定利奈唑胺的耐药临界浓度为1.0 μg/ml，当测试结核分枝杆菌MIC高于临界浓度时，判定结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药。采用结核分枝杆菌标准株H37Rv (ATCC 27249)作为对照。

六、基因组DNA提取

采用水煮法提取结核分枝杆菌基因组DNA[8]， 采用无菌生理盐水清洗改良中性罗氏培养基斜面生长的菌落，吸取菌悬液1 ml于无菌离心管中，85 ℃ 30 min灭活，12 000×g离心5 min，弃上清。菌体用500 μl TE(Tris-EDTA)缓冲液(pH 8.0)充分悬浮，95 ℃金属浴30 min，12 000×g离心5 min，将上清转移至无菌离心管中，冻存于-20 ℃冰箱中备用。

七、基因扩增及测序

提取结核分枝杆菌基因组DNA后，为了分析对利奈唑胺耐药的相关基因突变情况，选用特异性引物，分别扩增了所有利奈唑胺耐药相关基因23SrRNA(23S 核糖体RNA)，rplC(核糖体蛋白 L3)和rplD(核糖体蛋白 L4) 3个基因的序列(表2)。扩增体系：2×Taq预混液25 μl，两条引物各0.2 μmol、3 μl 基因组DNA。反应条件：预变性94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min， 72 ℃ 1 min，总计35个循环；72 ℃ 延伸 5 min。PCR产物送北京擎科生物技术有限公司测序。测序结果采用BioEdit软件与标准菌株H37Rv基因序列进行比对。

八、统计学分析

采用SPSS 14.0 软件进行不同组别利奈唑胺耐药率的卡方检验或Fisher确切概率法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、MDR结核分枝杆菌的耐药谱

在158株耐多药结核分枝杆菌菌株中，对一线抗结核药物链霉素和乙胺丁醇耐药的菌株数分别为115株 (72.7%)和86株(54.4%)；对二线抗结核药物氧氟沙星和卡那霉素耐药的菌株数分别为45株(28.5%)和8株(10.1%)。此外，传统药敏试验鉴定获得41株(25.9%)前广泛耐药菌株和10株(6.3%)广泛耐药菌株。

表2 本研究所用引物序列基因名称

注 F：上游引物； R：下游引物；S、C、D分别为基因名称自带的字母

二、不同组别结核分枝杆菌对利奈唑胺的耐药率比较

耐多药组、前广泛耐药组、广泛耐药组的MIC50和MIC90分别为(0.25 μg/ml 和1 μg/ml)、(0.25 μg/ml 和2 μg/ml)、(2 μg/ml 和32 μg/ml)。158株耐多药结核分枝杆菌中发现17株(10.8%)对利奈唑胺耐药。其中10株广泛耐药组中有6株对利奈唑胺耐药 (6/10)，明显高于耐多药组的5.6%(6/107)及前广泛耐药组的12.2%(5/41)，经Fisher确切概率法检验，差异均有统计学意义(P<0.001；P=0.004)；而耐多药组和前广泛耐药组对利奈唑胺耐药率经卡方检验，差异无统计学意义(χ2=1.87，P=0.307)。同时，3株菌株均来自于耐药水平最高(MIC=32 μg/ml)的广泛耐药组(表3)。

三、结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药的相关基因突变情况

本研究检测了158株耐多药菌株中的23SrRNA,rplC和rplD3个基因的序列(表4)。在17株利奈唑胺耐药菌株中，共发现5株(29.4%)在23SrRNA或(和)rplC基因发生突变，有4株(23.5%)rplC基因发生基因突变，包括2种不同的氨基酸置换：Cys154Arg(TGC460CGC)和His155Asp(CAC463GAC)。其中有3株(17.6%)耐药菌株带有第154位氨基酸突变，携带第155位氨基酸突变的结核分枝杆菌菌株的MIC为2 μg/ml；此外，有2株(11.6%)耐药菌株在23SrRNA基因的第2061位核苷酸发生突变，带有该突变类型的菌株的MIC均为32 μg/ml。未发现对利奈唑胺耐药菌株中有rplD突变；在对利奈唑胺敏感的菌株中，鉴定出2种非同义单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)，包括5株带有Arg79His(CGT→CAT)及6株带有Ser104Cys(AGC→TGC)。

讨 论

本研究首次对耐多药结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药情况进行了系统研究，并且分析了耐药基因的突变情况，获得了一定的参考数据。

一、广泛耐药结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药的相关机制

除了经典的耐药相关基因突变机制外，药物外排泵在结核病耐药机制中发挥着重要功能[12]。有研究表明耐药菌株中药物外排泵基因表达水平通常比敏感菌株更高[13]；此外，当联合药物外排泵抑制剂与抗结核药物治疗广泛耐药肺结核患者时，其治疗效果往往比单独使用抗结核药物更好[14]。上述结果提示，药物外排泵机制可能在广泛耐药菌株中发挥更重要的作用。因此，笔者推测，广泛耐药菌株具有的药物外排泵机制导致了其对利奈唑胺的耐药率明显高于耐多药菌株和前广泛耐药菌株。

表3 耐多药、前广泛耐药和广泛耐药菌株中利奈唑胺MIC分布特征

注 MIC50是指是指在一批实验中能抑制50%受试菌所需的最低抑菌浓度；MIC90是指是指在一批实验中能抑制90%受试菌所需的最低抑菌浓度。其中耐多药组，前广泛耐多药组和广泛耐多药组的MIC50分别为0.25 μg/ml，0.25 μg/ml和2 μg/ml；MIC90分别为1 μg/ml，2 μg/ml和32 μg/ml；表中括号外数值为菌株数，括号内数值为构成比

表4 17株对利奈唑胺耐药菌株在23S rRNA和rplC中的突变情况

注 L3蛋白为rplC编码蛋白

除了药物外排泵，微生物细胞壁通透性也是一个耐药的重要机制。细胞壁的厚度通常认为是细胞壁通透性的重要指标[15]。近期的一项研究通过观察全敏感、耐多药、广泛耐药结核分枝杆菌细胞壁的超微结构，发现广泛耐药结核分枝杆菌的细胞壁厚度明显高于耐多药和全敏感菌株[16]。因此，广泛耐药菌株增厚的细胞壁可能导致其细胞通透性降低，进而提高其对包括利奈唑胺在内的多种抗结核药物的耐药性。

二、23SrRNA和rplC基因突变与结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药相关

23SrRNA编码23S核糖体RNA，其第2061位点突变在金黄色葡萄球菌、耻垢分枝杆菌等中均有报道与对利奈唑胺耐药相关[17]，本研究鉴定结核分枝杆菌2061位点突变导致对利奈唑胺高水平耐药，与前述报道一致。rplC基因编码核糖体蛋白 L3，该蛋白大部分位于核糖体 50S 亚基的表面，有一个环状的尾部延伸至肽基转运中心(peptidyl transferase center,PTC)，利奈唑胺通过结合到 PTC 重叠区发挥抑菌作用[17]。虽然本研究未在对利奈唑胺耐药的菌株中发现rplD突变，但在对利奈唑胺敏感的菌株中，本研究鉴定出2种非同义单核苷酸多态性包括5株带有Arg79His (CGT→CAT)以及6株带有Ser104Cys (AGC→TGC)。鉴于这些SNP仅发生在对利奈唑胺敏感的菌株中，因此可考虑上述SNP可能与结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药无关。本研究首次鉴定到非同义突变His155Asp，携带该突变的结核分枝杆菌菌株的MIC为2 μg/ml，可能导致利奈唑胺低水平耐药；4株(23.5%)rplC基因有3株(17.6%)耐药菌株带有第154位氨基酸突变，提示第154位氨基酸突变较常见。然而，仍然有超过70%(12/17)对利奈唑胺耐药的菌株未能鉴定到在23SrRNA、rplC和rplD的基因突变。一方面，药物外排泵或者其他天然耐药机制通常导致低水平耐药；而靶标基因突变通常产生高水平耐药。因此，本研究中多株未发现基因突变的菌株可能有其他非核糖体突变机制参与到结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药之中。近期有研究表明，转录调控因子Rv0678基因突变导致的MmpL5外排泵上调表达可能是结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药的另一耐药机制[19]。考虑到本研究主要围绕利奈唑胺的耐药靶标基因开展，因此未开展对Rv0678基因的检测，后续研究将对未发现基因突变的菌株的Rv0678基因进行检测，以明确其在结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药中的作用[19-20]。另一方面，结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药的基因型与耐药表型的相关性较低(29.4%(5/17))，提示目前利奈唑胺尚不宜作为目标药物用于开发分子生物学诊断技术来诊断结核分枝杆菌对利奈唑胺的耐药性。

由于利奈唑胺主要应用于耐多药及广泛耐多药菌株的治疗，因此，本研究未增加对敏感菌株的检测。

总之，本研究首次分析了我国耐多药结核分枝杆菌对利奈唑胺的耐药性，同时发现广泛耐药结核分枝杆菌对利奈唑胺的耐药率明显高于耐多药菌株。同时23SrRNA和rplC基因突变与结核分枝杆菌对利奈唑胺耐药有相关性，但相关性仅为29.4%(5/17)，提示其他结核分枝杆菌对利奈唑胺的耐药机制有待于进一步研究。但因样本量较少，尤其是广泛耐药菌株仅10株，影响到数据的参考价值，希望今后扩大样本量进行进一步研究。

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(本文编辑：孟莉 范永德)

Analysis of the prevalence of linezolid resistance and mutations conferring linezolid resistance in multidrug resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from China

WANGQian,SONGYuan-yuan,WANGYu-feng,PANGYu,ZHAOYan-lin.

NationalTuberculosisReferenceLaboratory,NationalCenterforTuberculosisControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

s:ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org;PANGYu,Email:pangyu@chinatb.org

Objective To explore the prevalence of linezolid (Lzd) resistance among multidrug resistant (MDR)Mycobacteriumtuberculosisisolates from China, and to investigate the characteristics of mutations in genes conferring linezolid resistance. Methods A total of 158 MDR tuberculosis (TB) isolates, including 107 (67.7%) MDR-TB, 41 (26.0%) pre-extensively drug-resistant TB (pre-XDR), and 10 (6.3%) extensively drug-resistant TB isolates, were used in this study. The broth dilution method was used to determine minimal inhibitory concentrations (MIC) ofM.tuberculosisisolates against linezolid (Lzd). The reference isolate H37Rv (ATCC 27249) was used as a control. Lzd resistance was declared if the MIC value of theM.tuberculosisisolate was higher than the cut-off value of Lzd. In addition, the 23SrRNA,rplCandrplDgenes conferring Lzd resistance were sequenced in all isolates. Fisher’s exact test was performed to compare the proportions of Lzd resistance among different groups, and differences were considered significant whenP<0.05. Results 10.8% (17/158) of the 158 MDR tuberculosis isolates were Lzd-resistant. A higher frequency of Lzd-resistant isolates was identified among extensively drug resistant (XDR)M.tuberculosisisolates (6/10) than among MDR (5.6%, 6/107) and pre-XDR (12.2%, 5/41) isolates, and Fisher’s exact test revealed that the difference was significant (P<0.001 for MDR group;P=0.004 for pre-XDR group). In addition, only 5 (29.4%) of 17 Lzd-resistant isolates harbored mutations in 23SrRNAand/orrplC. A novel non-synonymous substitution His155Asp inrplCwas identified as a potential contributor to low-level Lzd-resistance (2 μg/ml) inM.tuberculosisfor the first time. Conclusion The prevalence of Lzd resis-tance among XDR isolates was significantly higher than that of MDR isolates. In addition, genetic mutations located in 23SrRNAandrplCwere associated with Lzd resistance inM.tuberculosis.

Mycobacterium,tuberculosis； Oxazolidinones； Linezolid； Tuberculosis, multidrug-resistant； Genes, bacteria； Mutation； Causality

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.004

“十二五”国家科技重大专项(2013ZX0003-003)

102206 北京，中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心办公室 国家结核病参比实验室

赵雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org；逄宇，Email:pangyu@chinatb.org

2016-07-11)