对异烟肼与丙硫异烟胺耐药的结核分枝杆菌临床分离株检测及相关基因突变的研究

刘银萍 王杰 张俊仙 梁艳 李洪敏 吴雪琼



对异烟肼与丙硫异烟胺耐药的结核分枝杆菌临床分离株检测及相关基因突变的研究

刘银萍 王杰 张俊仙 梁艳 李洪敏 吴雪琼

目的 研究MTB对异烟肼(INH)和丙硫异烟胺(Pto)的耐药情况，及从临床标本中的MTB临床分离株直接检测katG和inhA基因型的价值。方法 回顾性调查解放军第三〇九医院全军结核病研究所2014年8月至2015年8月住院确诊，并经抗结核药物治疗有效的结核病患者，共104例。患者临床标本经培养鉴定为MTB，然后通过绝对浓度法同时进行INH和Pto药物敏感性试验(简称“药敏试验”)，并用基因芯片检测MTBkatG和inhA基因型。结果 104例患者的MTB临床分离株经绝对浓度法药敏试验检测显示：20例(19.2%)对INH耐药，其中3例高度耐药、17例低度耐药；5例(4.8%)对Pto耐药，其中1例高度耐药、4例低度耐药；INH与Pto的交叉耐药率20.0%(4/20)。以传统药敏试验为对照，20例对INH耐药患者中，基因芯片检测10例(50.0%)发生katG基因315位点突变，3例(15.0%)发生inhA基因-15位点突变，1例(5.0%)发生双基因突变；84例INH敏感患者中，7例(8.3%)发生katG基因315位点突变，5例(6.0%)发生inhA基因-15位点突变。基因芯片检测katG基因315位点突变预示MTB对INH耐药的敏感度为55.0%(11/20)，特异度为91.7%(77/84)；inhA基因-15位点突变预示MTB对INH和Pto耐药的敏感度分别为20.0%(4/20)和60.0%(3/5)，特异度分别为94.0%(79/84)和93.9%(93/99)。结论 大多数结核病患者的MTB临床分离株对INH和Pto耐药水平低，对Pto的耐药率低，katG315和inhA-15基因突变与MTB对INH耐药密切相关，inhA-15基因突变与MTB对Pto耐药密切相关，应用基因芯片可快速检测临床标本中MTB的INH和Pto耐药基因型。

分枝杆菌，结核； 异烟肼； 丙硫异烟胺； 抗药性，细菌； 芯片分析技术

异烟肼(isoniazide，INH)是一线抗结核药物，是结核病标准化疗方案的重要组成药物。根据2015年世界卫生组织报告，2014年全球约有48万例耐多药结核病(MDR-TB)患者，而我国约有5.7万例[1]。由此可见，制定有效的MDR-TB治疗方案对于控制结核病疫情至关重要。结核分枝杆菌(MTB)对INH耐药后，临床上通常应用丙硫异烟胺(protionamide，Pto)来代替INH组成治疗方案[2]。Pto和乙硫异烟胺(ethionamide，Eto)均是异烟酸的衍生物，两者与INH作用相似，有一定的交叉耐药性[3]，可通过抑制MTB分枝菌酸的合成而发挥抗结核作用[4]。目前的研究已表明MTB耐INH主要与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因(katG)和烯酰基运载蛋白还原酶的调控基因(inhA)突变有关[5]。MTB耐Eto主要是由于参与分枝菌酸合成的inhA编码基因和启动子区域突变所致[6]。但目前尚未见MTB对Pto耐药与inhA相关性的研究报道。因此，本研究将探讨MTB对INH与Pto的耐药情况，并研究应用基因芯片从临床标本中直接检测MTBkatG基因315位和inhA基因-15位基因型的临床价值。

资料与方法

1.一般资料：对解放军第三〇九医院全军结核病研究所2014年8月至2015年8月住院确诊，并经抗结核治疗有效的结核病患者进行回顾性调查。选择104例鉴定为MTB感染，同时具有INH、Pto传统药物敏感性试验(简称“药敏试验”)和INH耐药基因芯片检测结果的患者作为研究对象。研究对象中，78例留取痰标本、10例留取支气管灌洗液、10例留取脓液、4例留取胸腔积液、2例留取病理组织。

2.分枝杆菌培养鉴定：按照《结核病诊断实验室检验规程》[7]，应用含对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)的BACTEC 960分枝杆菌培养系统进行分枝杆菌鉴别培养，选择PNB阴性、TCH阳性生长物经抗酸染色证实后鉴定为MTB的患者。

3.传统分枝杆菌药敏试验：按照《结核病诊断实验室检验规程》[7]采用绝对浓度法进行传统的MTB药敏试验。以MTB H37Rv标准株作为质控菌株，耐药判定标准：高、低度耐INH浓度分别为1 μg/ml和10 μg/ml；高、低度耐Pto浓度分别为10 μg/ml和100 μg/ml。

4.基因突变检测：采用晶芯®MTB耐药检测基因芯片(购自博奥生物集团有限公司)，按照说明书提供的标准操作规程进行PCR扩增和芯片杂交。应用MTB耐药检测芯片判别系统进行芯片扫描和结果判读。

5.统计学分析：采用SPSS 17.0软件进行数据处理。计算基因芯片检测法的敏感度和特异度；计算各药物耐药发生率和交叉耐药率，交叉耐药率=交叉耐药菌株数/INH耐药菌总株数×100%；同一药物高度耐药和低度耐药发生率间的比较采用卡方检验或Fisher精确概率法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1．基本情况：104例确诊的结核病患者中，40例为肺结核，29例为肺结核并发结核性胸膜炎，17例为肺结核并发气管、支气管结核，5例为肺结核并发骨关节结核、5例为骨关节结核，3例为肺结核并发淋巴结结核，2例为肺结核并发结核性心包炎，结核性胸膜炎、淋巴结结核和肾结核各1例。男69例，女35例，平均年龄(45.1±19.5)岁。

2.耐药情况：通过绝对浓度法同时对104例研究对象的临床样本进行INH和Pto药敏试验，结果显示：20例(发生率为19.2%)对INH耐药，其中3例高度耐药(发生率为2.9%)、17例低度耐药(发生率为16.3%)，低度耐药的发生率明显高于高度耐药(χ2=10.84，P=0.000)；5例(发生率为4.8%)对Pto耐药，其中1例(发生率为1.0%)高度耐药、4例(3.8%)低度耐药，低度耐药与高度耐药发生率的差异无统计学意义(P=0.150)；4例INH与Pto交叉耐药，耐药率为20.0%(4/20)，见表1。

3.基因突变情况：应用基因芯片检测104例研究对象MTBkatG基因315位点和inhA基因-15位点突变情况，见表2。以传统药敏试验为依据，20例INH耐药患者中，基因芯片检测10例(50.0%)发生katG基因315位点突变，3例(15.0%)发生inhA基因-15位点突变，1例(5.0%)发生双基因突变，则基因芯片检测katG基因315位点突变预示INH耐药的敏感度为55.0%(11/20)，inhA基因-15位点突变预示INH耐受的敏感度为20.0%(4/20)，两个耐药基因检测总的敏感度为70.0%(14/20)；84例INH敏感患者中，7例(8.3%)发生katG基因315位点突变，5例(6.0%)发生inhA基因-15位点突变，则基因芯片检测katG基因315位点突变的特异度为91.7% (77/84), 检测inhA基因-15位突变的特异度为94.0% (79/84), 两个耐药基因检测总的特异度为85.7%(72/84)。INH耐药基因检测与传统药敏试验的一致率为82.6%(86/104)。

5例Pto耐药患者中，基因芯片检测只有3例发生inhA基因-15位点突变，检测敏感度为60.0%(3/5)；99例Pto敏感患者中，基因芯片检测6例(6.1%)发生inhA基因-15位点突变，检测的特异度为94.0%(93/99)。PtoinhA耐药基因检测与传统药敏试验的一致率为92.3%(96/104)。

讨 论

根据2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[8]，我国结核病患者对INH的耐药率最高(28.6%)，对Pto的耐药率为12.9%，均高于本研究的结果(分别为23%、5%)；也高于安徽省的INH耐药情况(20.0%)，但Pto的耐药情况相同(12.9%)[9]。李心德[10]分析了174株MDR-TB对二线抗结核药的耐药情况，结果显示，Pto的耐药率为12.9%。本研究Pto的低耐药率可能系患者来源不同所致，也可能是表型药敏试验所用的商品化培养基的Pto耐药界限值较高，导致的假敏感。

INH是在过氧化氢酶-过氧化物酶的作用下转化成活性型异烟酸而发挥抗结核作用的。研究已证明，MTB的katG基因突变会导致过氧化氢酶-过氧化物酶活性丧失或活性降低，使INH不能转化为活性型而发生耐药[4]。Seifert等[5]对2000—2013年来自49个国家的118篇关于INH耐药基因突变的研究进行系统综述，发现全球INH耐药菌株64%与katG基因315位点突变相关，19%由inhA基因-15位点突变所致。由于大多数MTB耐药发生于katG基因315位点和inhA基因-15位点，这两个位点已成为INH耐药基因型检测的主要位点。本研究结果也证实了这两个位点的耐药基因型检测是可行的，并且以传统药敏试验结果为对照，其具有较高的敏感度、特异度和一致率。本研究发现17例患者katG基因315位点突变，其中只有1例是高度耐药株，其余均为低度耐药株或敏感株。这是因为该位点突变只是导致过氧化氢酶-过氧化物酶活性降低，使INH转换为异烟酸的效率降低，临床加大剂量继续用药是有效的[11]。

表1 104例研究对象异烟肼和丙硫异烟胺传统药敏试验结果

表2 104例研究对象基因芯片检测结果与传统药敏试验结果的比较

Pto与Eto均为异烟酸的衍生物，因此，从原理上讲，katG基因突变似乎与Pto和Eto无关。本研究中Pto耐药株中仅见1例katG基因突变；Morlock 等[12]未发现katG基因突变与Eto耐药相关。但Pto、Eto与INH转化后的活性物质作用相似，可抑制MTB分枝菌酸的合成。虽然本研究检测Pto的耐药株较少，但以传统药敏试验为对照，基因型检测具有较高的特异度和一致率，也初步提示Pto耐药可能与inhA基因-15位点突变密切相关。针对此结论，笔者将扩大样本量进一步研究证实。这一结果也预示INH与Pto和Eto之间存在一定的交叉耐药率。本研究中，inhA基因-15位点突变在INH耐药株中所占比例较小，且主要表现为低度耐药；传统药敏试验结果显示，INH与Pto的交叉耐药率也只有20.0%；3例INH高度耐药的患者Pto表现为敏感或低度耐药。由此提示，INH耐药尤其是无inhA基因突变患者可选择Pto或Eto代替INH进行治疗[2]。

综上所述，本研究大多数标本中MTB对INH和Pto耐药水平低，对Pto的耐药率低，提示临床上可应用Pto代替耐药的INH用于结核病治疗；katG基因315位点和inhA基因-15位点突变与INH耐药密切相关，inhA基因-15位点突变与Pto耐药密切相关，应用基因芯片快速检测临床标本中MTB的INH和Pto耐药基因型，可指导临床合理用药。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2015 [R/OL]. (2015-11-16)[2016-06-07]. http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/.

[2] 中国防痨协会. 耐药结核病化学治疗指南(2015). 中国防痨杂志, 2015, 37(5): 421-469.

[3] Schaaf HS,Victor TC,Venter A,et al. Ethionamide cross- and co-resistance in children with isoniazid-resistant tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, 2009, 13(11): 1355-1359.

[4] Vilchèze C, Jacobs WR Jr. Resistance to isoniazid and ethionamide inMycobacteriumtuberculosis: genes, mutations, and causalities. Microbiol Spectr, 2014, 2(4): MGM2-0014-2013.

[5] Seifert M, Catanzaro D, Catanzaro A, et al. Genetic mutations associated with isoniazid resistance inMycobacteriumtuberculosis: a systematic review. PLoS One, 2015, 10(3): e0119628.

[6] Machado D, Perdigão J,Ramos J,et al. High-level resistance to isoniazid and ethionamide in multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisof the Lisboa family is associated with inhA double mutations. J Antimicrob Chemother, 2013, 68(8): 1728-1732.

[7] 中国防痨协会基础专业委员会. 结核病诊断实验室检验规程. 北京:中国教育文化出版社, 2006: 55-57.

[8] 全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组, 全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室. 2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告. 中国防痨杂志, 2012, 34(8): 485-508.

[9] 徐东芳, 王庆, 李孳, 等. 安徽省420株结核分枝杆菌对一线和二线抗结核药物药敏结果分析. 中国人兽共患病学报, 2014, 30(1): 54-57.

[10] 李心德. 174株耐多药结核分枝杆菌对二线抗结核药耐药情况分析. 国际检验医学杂志, 2014, 35(13): 1732-1733,1748.

[11] Katiyar SK, Bihari S, Prakash S, et al. A randomised controlled trial of high-dose isoniazid adjuvant therapy for multidrug-resistant tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, 2008, 12(2): 139-145.

[12] Morlock GP, Metchock B, Sikes D, et al.ethA,inhA, andkatGloci of ethionamide-resistant clinicalMycobacteriumtuberculosisisolates. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(12): 3799-3805.

(本文编辑：李敬文)

A study on test and related genotypes of isoniazid-and-prothionamide-resistantMycobacteriumtuberculosisisolated from clinical specimens

LIUYin-ping,WANGJie,ZHANGJun-xian,LIANGYan,LIHong-min,WUXue-qiong.

ArmyTuberculosisPreventionandControlKeyLaboratory,BeijingKeyLaboratoryofNewTechniquesofTuberculosisDiagnosisandTreatment,InstituteforTuberculosisResearch,the309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,China

WUXue-qiong,Email:xueqiongwu@139.com

Objective To investigate isoniazid (INH) and prothionamide (Pto) resistances inMycobacteriumtuberculosis(MTB), and to assess the value of direct detection ofkatGandinhAgenotypes in MTB isolated from clinical specimens. Methods A total of 104 hospitalized TB patients undergoing effective anti-MTB treatment from Institute for Tuberculosis Research, the 309th Hospital of Chinese PLA between August 2014 and August 2015 were retrospectively studied. Clinical specimens were identified as MTB by culture media containing nitrobenzoic acid (PNB) and thiophene-carboxylic acid hydrazide (TCH) and INH and Pto drug susceptibility tests were performed at the same time by absolute concentration method. The mutations of MTBkatGandinhAgenes were detected using gene chip. Results Of the 104 clinical specimens, the results of drug susceptibility tests showed that 20 cases (19.2%) were INH-resistant, in which 3 cases were with high-level resistant, and 17 cases were with low-level resistant; 5 cases (4.8%) were Pto-resistant, including 1 case with high-level and 4 cases with low-level resistance. The cross-resistant rate between INH and Pto was 20.0% (4/20). Compared to conventional drug susceptibility test, when using gene chip in the 20 TB patients with INH resistance, 10 cases (50.0%) hadkatG315 mutations, 3 cases (15.0%) hadinhA-15 mutations, and 1 case (5.0%) had the mutations atkatG315 andinhA-15. Of the 84 INH-sensitive TB patients, 7 cases (8.3%) hadkatG315 mutations, 5 cases (6.0%) hadinhA-15 mutations. The sensitivity and specificity ofkatG315 mutations detection by gene chip for INH-resistance MTB were 55.0% (11/20) and 91.7% (77/84), respectively. The sensitivities ofinhA-15 mutation for INH and Pto resistance were 20.0% (4/20) and 60.0% (3/5), respectively; and the specificities were 94.0% (79/84) and 93.9% (93/99), respectively. Conclusion Most MTB isolated from clinical specimens were at low level of INH and Pto resistance. The rate of Pto-resistant in MTB was also low. ThekatG315 andinhA-15 mutations were closely related with INH resistance, and theinhA-15 mutation was closely related with the Pto resistance. Using gene chip could rapidly detect the INH- and Pto-resistant genotypes of MTB in clinical specimens.

Mycobacteriumtuberculosis; Isoniazid; Prothionamide; Drug resistance, bacterial; Microchip analytical procedures

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.005

“十一五”国家重大传染病专项(No.2008ZX10003-001)；军队医学科技“十二五”重点项目(BWS11J050)；解放军第三〇九医院课题(2014MS-012)

100091 北京，解放军第三〇九医院 全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室 结核病诊疗新技术北京市重点实验室

吴雪琼，Email: xueqiongwu@139.com

2016-06-08)