薄荷油与薄荷醇促进中药成分经皮吸收的对比研究

兰颐 王景雁 陶野 茹庆国 王逸飞 于竞新 刘艳 吴清

[摘要]该文拟探讨并比较薄荷油与薄荷醇对中药复杂成分的经皮促透作用特征规律。选择系列不同logP（油水分配系数）中药有效成分作为模型药物，即蛇床子素（logP=385）、川芎嗪（logP=234）、阿魏酸（logP=126）、葛根素（logP=-035）、京尼平苷（logP=-101），简化并表征中药复杂成分体系，采用体外透皮试验，对比分析薄荷油与薄荷醇的经皮促透作用特征。同时，采用傅利叶变换红外光谱（FTIR）技术进一步比较薄荷油与薄荷醇对皮肤角质层内在分子结构的影响。研究结果显示，适宜浓度的薄荷油与薄荷醇均可促进不同logP药物成分的经皮吸收，薄荷醇作用下药物经皮促透倍数对数值与药物logP向于负线性关系，薄荷油作用趋向于呈抛物线关系，但都表现出对logP较低药物（即亲水性药物）具更佳的经皮促透效果，其作用趋势相似。红外光谱研究显示，薄荷油与薄荷醇主要通过影响角质层脂质而影响皮肤屏障功能，且作用强度相近，与体外透皮试验结果一致。可知，薄荷油与薄荷醇的体外经皮促透作用特征相似，且对角质层内在分子结构影响相同，因此，作为经皮促透剂应用条件下，可以考虑选择成分单一的薄荷醇代替组成复杂的薄荷油。

[关键词]薄荷油；薄荷醇；经皮促透剂；经皮吸收；傅利叶变换红外光谱

[Abstract]The aim of this paper was to investigate and compare the penetrationenhancing characteristics of menthol and essential oil from Mentha haplocalyx（Mhaplocalyx oil） on the transdermal absorption of the complex traditional Chinese medicine（TCM） components A series of TCM components were selected as model drugs based on their lipophilicity （logP value）， namely osthole（OT， logP=385）， tetramethylpyrazine（TMP， logP=234）， ferulic acid（FA， logP=126）， puerarin（PR， logP=-035） and geniposide（GP， logP=-101）， in order to simply and characterize the TCM complex components system Transdermal experiment in vitro was employed to investigate and compare the penetrationenhancing characteristics of menthol and Mhaplocalyx oil on the transdermal absorption of these model drugs Meanwhile， Fourier transform infrared spectroscopy（FTIR） was used to further compare the effect of menthol and M haplocalyx oil on the molecular structure of stratum corneum（SC） The results showed that both of menthol and Mhaplocalyx oil at proper concentration could promote the transdermal absorption of the selected model drugs After application of menthol， the drug logP values gradually tended to have negative linear relationship with the logarithm of penetration enhancement ratio（ER）； while after application of Mhaplocalyx oil， the logP values tended to have parabolic relationship with the logarithm of ER However， both menthol and Mhaplocalyx oil exhibited higher efficiency for the drugs with relative low lgP value（ie hydrophilic drugs）， with similar penetrationenhancing characteristics between these two Infrared spectroscopy results showed that menthol and Mhaplocalyx oil could affect the skin barrier functions mainly via stratum corneum lipids， with similar effect intensity， and this was consistent with the results of transdermal experiment in vitro Thus， Menthol had similar penetrationenhancing characteristics with Mhaplocalyx oil， and had same effect on the SC molecular structure Therefore， as transdermal penetration enhancer， the menthol with single composition could be considered to replace Mhaplocalyx oil with complex compositions

[Key words]essential oil from Mentha haplocalyx； menthol； transdermal penetration enhancer； transdermal absorption； FTIR

doi：10.4268/cjcmm20160825

薄荷为唇形科多年生草本植物薄荷Mentha haplocalyx Briq的茎叶，在中药外用制剂中应用广泛，多利用其“芳香走窜”特性而发挥“率领群药、直达病所”之功，具有类似现代经皮促透剂的作用。薄荷的有效部位主要为其挥发油成分，因此，薄荷油作为促透剂成为目前研究的热点，文献研究也显示[12]，薄荷油作为促透剂可促进某些成分的经皮吸收，如L肉碱、左旋延胡索乙素等。其中，薄荷醇是薄荷油中含量最高的一种成分，一般约占50%以上[3]，文献研究显示，薄荷醇作为促透剂也具有良好的经皮促透效果[45]。

但是，薄荷油与薄荷醇的经皮促透研究多集中在对某单一成分的促透评价，对中药复杂成分的经皮促透特征目前尚不清楚，同时，薄荷醇作为薄荷油中最主要成分，是否可用成分单一的薄荷醇代替组成复杂的薄荷油用于中药外用制剂的经皮促透，有待进一步研究。因此，本文基于现代经皮定量结构渗透性关系（quantitative structurepermeation relationships， QSPRs）研究结果，即药物理化性质中logP（油水分配系统）是影响药物经皮吸收最主要的影响因素[67]。因此，选择系统不同logP有效成分简化并表征复杂中药成分体系，即蛇床子素（osthole， OT，logP=385）、川芎嗪（tetramethylpyrazine， TMP，logP=234）、阿魏酸（ferulic acid， FA，logP=126）、葛根素（puerarin， PR，logP=-035）、京尼平苷（geniposide，GP，logP=-101），通过测定其经皮促透作用情况，对比探讨薄荷油与薄荷醇的经皮促透作用特征。同时，采用傅利叶变换红外光谱技术（FTIR）进一步比较薄荷油与薄荷醇对角质层内在分子结构的影响，从而为其在中药外用制剂中的合理应用提供科学指导。

1材料

TK20B型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；岛津高效液相色谱系统（包括LC20AT泵、SPD20A紫外检测器，日本岛津公司）；Nexus型全反射傅利叶变换红外光谱仪（ATRFTIR，美国ThermoNicolet公司）；Sartorius BS 110型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；CP7800型电动递毛器（科德士电器有限公司）。

薄荷药材购于北京本草方源药业有限公司，批号20131007，产地江苏，经北京中医药大学中药炮制系谭鹏副教授鉴定为唇形科植物薄荷M haplocalyx的干燥地上部分，符合《中国药典》（2010年版）相应项标准。薄荷油采用2010年版《中国药典》附录挥发油提取甲法提取，得淡黄色油状液体，无水硫酸钠脱水后避光密闭保存。GCMS测定其主要成分为薄荷醇（menthol， 5100%）、薄荷酮（menthone， 611%）、瓜菊醇酮（cinerolone， 319%）、优香芹酮（eucarvone， 258%）、胡椒酮（piperitone， 219%）、异薄荷酮（isomenthone， 199%）、长叶薄荷酮（pulegone， 132%）等[8]。

薄荷醇、阿魏酸（纯度>9800%）均购于国药集团化学试剂有限公司，批号分别为F20110811，20120328；川芎嗪购于SigmaAldrich公司，批号为14003DEV；蛇床子素、葛根素、京尼平苷均购于NCE Biomedical公司，纯度均>9800%，批号分别为20131209，20131209，20131209；苄泽98（Brij 98）购于SigmaAldrich公司，批号为MKBP0994V；丙二醇购于SigmaAldrich公司，批号为WXBB1075V；冰醋酸购于北京化工厂，批号为20080103；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

健康雄性SD大鼠，5周龄，体重约（200±10） g，由斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，合格证号SCXK（京）2011004。

2方法

21模型药物HPLC法的建立

分别配制各模型药物对照品的对照液、体外透皮试验空白接收液及含药体外透皮试验接收液，考查各方法专属性、线性关系、精密度及相对回收率，见表1。结果显示，接受液中其他成分对各模型药物的测定均无干扰，其中，蛇床子素在001～100 mg·L-1线性关系良好，低、中、高3个质量浓度（01，10，50 mg·L-1）的日内精密度分别为029%，0060%，014%，日间精密度分别为18%，013%，019%，相对回收率分别为9563%，1006%，1001%；川芎嗪在01～400 mg·L-1线性关系良好，低、中、高3个质量浓度（1，20，200 mg·L-1）的日内精密度分别为035%，012%，020%，日间精密度分别为24%，25%，27%，相对回收率分别为9559%，9580%，9761%；阿魏酸在01～200 mg·L-1线性关系良好，低、中、高3个质量浓度（1，20，100 mg·L-1）的日内精密度分别为038%，021%，025%，日间精密度分别为18%，015%，014%，相对回收率分别为9172%，9074%，9524%；葛根素在01～400 mg·L-1线性关系良好，低、中、高3个质量浓度（1，20，200 mg·L-1）的日内精密度分别为048%，032%，026%，日间精密度分别为022%，0070%，0050%，相对回收率分别为9748%，9774%，9927%；京尼平苷在01～400 mg·L-1线性关系良好，低、中、高3个质量浓度（1，20，200 mg·L-1）的日内精密度分别为079%，072%，12%，日间精密度分别为17%，23%，12%，相对回收率分别为9641%，9784%，9959%。

22体外经皮渗透试验

221离体鼠皮的制备在体外经皮渗透实验前，取雄性SD大鼠断颈处死，用剃毛器小心剃去腹部鼠毛后剥离其腹部皮肤，在玻璃板上小心剔除皮下脂肪组织和黏连物，然后用磷酸缓冲液（PBS）清洗干净，待用。

222供给液的制备为求算薄荷醇和薄荷油的经皮透渗稳态流速、滞后时间，采用无限给药技术进行体外透皮实验。故供给池中药液的配制方法为：将足量的模型药物分别溶于丙二醇水（80∶20）混合溶剂系统中，加入相应浓度薄荷醇或薄荷油，涡旋5 min，超声15 min使其充分溶解。

223体外透皮试验将剥离的大鼠腹皮固定于FranZ扩散池之间（扩散池有效扩散面积为177 cm2，接收池体积为7 mL），皮肤角质层面朝向供给池，真皮层面朝向接收池。在加入供给液前平衡约05 h，供给池加入供给液2 mL，然后封口膜封住供给池口防止水分蒸发；接收池中蛇床子素透皮接收液选择3% Brij98 PBS为接收液，其他药物均以001 mol PBS溶液（pH 72）为接收液[14]。温度设置为（32±03） ℃，接收池搅拌子转速为300 r·min-1。在1，2，4，6，8，10，12，22，24 h分别取样1 mL，然后向接收池中补加相同体积新鲜接受液，所得样品过滤后，按照建立的方法测定药物含量。

23衰减全反射傅利叶变换红外光谱（ATRFTIR）研究

将制得的大鼠腹皮置于04%胰蛋白酶溶液中，室温放置约10 h，然后用棉签小心分离皮肤角质层，取得的角质层片用蒸馏水洗清干净，置于真空干燥箱干燥，备用。

取大小适宜（1 cm×1 cm）的干燥角质层片，分别置于10 mL离心管内。试验分为空白组（Blank组，不做任何处理）、对照组[Control组，丙二醇水（20∶80）溶剂处理]、薄荷醇组和薄荷油处理组（配制方法同透皮试验挥发油）。分别取干燥角质层片置于约5 mL各组对应促透剂溶液中，室温条件下处理12 h后，用蒸馏水清洗掉角质层片上残留溶剂，放置于真空干燥箱37 ℃脱水干燥。干燥后的角质层片采用衰减全反射傅利叶变换红外光谱进行扫描测定，仪器参数设置为：分辨率2 cm-1；扫描次数为100；扫描范围为650～4 000 cm-1。

24透皮数据处理及统计分析

根据药物单位面积累积透过量与时间作图得到药物经皮渗透动力学曲线，各药物的累积透过量可按下式计算。

Q=（Cn×V+∑n-1i=1Ci×Vi）/A

其中，Q（μg·cm-2）为单位面积累积透过量，V为扩散池的体积（7 mL），Vi为每次取样体积，Cn和Ci分别为第n次和第i次取样时接收液中药物浓度，A为扩散面积（177 cm2）。以累积透过量对时间作图，所得直线部分（6～12 h）的斜率即为稳态透皮速率（Jss，μg·cm-2·h-1），直线部分反向延长线与X轴的交点即为滞后时间（Tlag，h）。为进一步比较促透剂的促渗效果，按下列公式计算其经皮促渗倍数：ER（enhancement ratio）=Jss（含促透剂）/Jss（不含促透剂）；实验数据以±s表示，以SPSS 160软件进行数据统计分析，组间比较采用t检验，P<005为差异有统计学意义。

3结果

31促透剂对模型药物的经皮促透作用情况

薄荷醇与薄荷油对各模型药物渗透过大鼠皮肤的体外渗透动力学曲线及相关经皮渗透参数的影响分别见图1，表2。由图表可知，除个别模型药物外，1%薄荷醇和薄荷油对各模型药物的经皮渗透参数（如体外稳态经皮速率、累积透过量等）没有显著影响，而随着促透剂浓度的增加，对各模型药物的经皮渗透速率增加明显，并表现出显著性差异（P<005），表明薄荷醇与薄荷油对不同lgP药物经皮渗透的影响呈现出浓度依赖性关系。其中，5%薄荷醇对蛇床子素、川芎嗪、阿魏酸、葛根素及京尼平苷的增透倍数分别为368，2433，14748，2 22660，1 74950；5%薄荷油对蛇床子素、川芎嗪、阿魏酸、葛根素及京尼平苷的增透倍数分别为803，1514，20690，3 31300，80960。同时，在薄荷醇和薄荷油作用下，各模型药物经皮渗透的滞后时间（Tlag）逐渐延长，并随促透剂浓度的增加表现出显著性差异（P<005）。该研究结果显示，适宜浓度的薄荷醇与薄荷油均可促进不同lgP药物有效成分的经皮吸收。

32不同logP模型药物与其促透倍数的相关性

将不同浓度薄荷醇和薄荷油作用下各模型药物经皮促透倍数的对数值与对应药物logP进行关联分析，见图2。在薄荷醇作用下，模型药物经皮促透倍数对数值与药物logP趋向于负线性关系，其中1%薄荷醇作用下的关系式为lgER=-004logP+018（r=0413 6）；3%薄荷醇作用下的关系式为lgER=-034logP+152（r=0903 2）；5%薄荷醇作用下的关系式为lgER=-059logP+287（r=0988 1）。由于1%薄荷醇作用下的经皮促透作用相对较弱，其促透倍数未表现出显著性差异，故该浓度薄荷醇作用下并未表现出较明显的关系。而随着薄荷醇应用浓度的增加，促透倍数对数值与药物logP逐渐呈负线性相关，表明适宜浓度薄荷醇作用下对logP越低的有效成分（即亲水性较强成分）的经皮促透倍数越高。值得注意的是，虽然相关性分析结果显示随着薄荷醇应用的增加，药物logP与促透倍数对数值表现出较明显的负线性相关，但3%和5%薄荷醇对京尼平苷的促透倍数均低于其对葛根素的促透倍数（图2），也提示当药物logP低于某值后（估计logP约为-1～-05），薄荷醇的经皮促透作用开始逐渐下降，但该结论需选择更多该区间内药物进行测定以进一步证实。

在薄荷油作用下，模型药物经皮促透倍数对数值与药物logP趋向于呈抛物线关系式，其中，3%薄荷油作用下为：lgER=-0055 7logP2+0075logP+0729 2（r=0554 0）；5%薄荷油作用下为：lgER=-0016 6logP2-0480 6logP+2827 9（r=0931 8）；由于1%薄荷油未表现出明显的促透作用，因此1%薄荷油也未表现出明确的作用关系。该结果也提示薄荷油作用下，对不同logP药物成分的经皮促透作用特点表现为：药物经皮促透倍数随logP降低而增加，但当logP降到某值后，则开始表现出随logP降低而降低，表明薄荷油对适宜亲水性药物（logP估计值约为-050）具有最佳促透效果。

由上述结果可知，虽然薄荷醇作用下药物经皮促透倍数对数值与药物logP趋向于负线性关系，而薄荷油趋向于呈抛物线关系，但都表现出对logP较低药物（即亲水性药物）具更佳的经皮促透效果，其作用趋势相似。

33FTIR分析

角质层这种特殊的“砖墙”结构决定了角质层是药物经皮吸收的主要限速过程，其主要成分为脂质与角蛋白，且其脂质在药物经皮吸收屏障中发挥主要作用[1516]。由于FTIR可以获取角质层脂质和角蛋白次级结构吸收峰信息，因此利用该技术可判断角质层分子结构的变化情况。正常大鼠皮肤角质层红外吸收光谱峰（图3Blank组）的归属如下：脂质特征吸收峰约为2 917 cm-1，为脂质CH不对称振动吸收峰（νas），2 849 cm-1为脂质CH对称振动吸收峰（νs）；角蛋白特征吸收峰约为1 652，1 538 cm-1，当这些物质吸收振动峰位发生移动，则表明其结构发生了一定改变[1718]。根据体外透皮试验结果，选择有适宜促透效果的促透剂进行红外光谱分析，因此，选择3%薄荷油与薄荷醇比较其对皮肤角质层分子结构的影响。

薄荷醇与薄荷油作用于角质层后相应脂质和角蛋白的红外光谱图和吸收峰位移变化情况中，见表3，由图表数据可知，未经处理的大鼠角质层（Blank组）与经PGH2O（80∶20）混合溶剂处理的对照组相比，脂质碳氢振动峰和角蛋白吸收峰没有明显移动，表明该溶剂系统对皮肤结构没有显著影响，与前期文献报道相一致[18]。而在薄荷油和薄荷醇作用下，脂质碳氢不对称振动吸收峰（νas）和对称振动吸收峰（νs）分别向右移动271，296 cm-1和085，161 cm-1，而对角蛋白酰胺吸收峰没有明显影响，表明薄荷油和薄荷醇主要通过影响角质层脂质而影响皮肤屏障作用，且两者对角质层分子结构的影响相同，这与体外透皮试验结果也相一致。

4讨论

药物理化性质或结构特征通常直接决定了其生物活性，国内外许多研究进行了大量经皮定量结构渗透性关系研究（QSPRs），拟将化合物的皮肤通透性与其理化性质（如lgP，相对分子质量，酸碱性等）或结构特征用统计学方法联系起来。其中，Pottst Guy等提出了较为经典也是文献引用最多的QSPRs模型，即lgKp=-63+071×lgP-0006 1×MW，（lgKp为人体皮肤通透系数，lgP为辛醇水分配系数的对数值，MW为药物相对分子质量）。其他QSPRs研究结果也显示，药物皮肤通透性（以经皮速率或通透系数表示）与药物的lgP具有最为密切的相关关系。因此，本研究选择系列较大范围内不同lgP有效成分来简化并表征复杂成分体系，以对比研究薄荷油和薄荷醇作为促透剂的经皮促透作用特征。

在体外透皮试验供给液的选择中，本实验选择丙二醇水 80∶20混合溶剂系统，主要是基于以下2个方面的考虑，首先，该混合溶剂系统可溶解较大极性范围的药物，由于本研究所选择的模型药物极性大小不同，使用该溶剂系统可保证在同一供给液条件下进行体外评价，确保体外透皮试验的均一性。其次，丙二醇水 80∶20溶剂系统对皮肤影响较小，不会改变皮肤的正常生理结构[19]。

该实验研究显示，虽然薄荷醇作用下药物经皮促透倍数对数值与药物lgP趋向于负线性关系，而薄荷油的作用趋向于抛物线关系，但两者的经皮促透作用强度和趋势相似。红外光谱研究结果也显示，薄荷醇与薄荷油对皮肤角质层分子结构的影响也大致相同。同时，考虑到薄荷油在实际提取过程中出油率相对较低，该挥发油的获得成本较高，且成分比例难以有效控制，而薄荷醇目前已可通过化学合成获得，成本较低，且为纯度较高的单体成分，易于质量控制。因此，该研究结果提示，作为经皮促透剂应用条件下，可考虑选择成分单一也易于控制的薄荷醇代替组成复杂的薄荷油。

[参考文献]

[1]钱励，马臻，张望刚，等 透皮促进剂对左旋延胡索乙素体外经皮渗透的影响[J] 中国中药杂志，2011，36（13）： 1729

[2]张岭，陈莉，张莉，等 挥发性促透剂对L肉碱体外经皮渗透的影响[J] 解放军药学学报，2011，27（4）： 337

[3]梁呈元，佟海英，赵志强，等 水蒸气蒸馏法与超临界 CO2萃取法提取薄荷油的化学成分比较[J] 林产化学与工业，2007，27（1）： 81

[4]Jain A K， Thomas N S， Panchagnula R Transdermal drug delivery of imipramine hydrochloride： I effect of terpenes[J] J Control Release， 2002， 79（1）： 93

[5]Olivella M S， Lhez L， Pappano N B， et al Effects of dimethylformamide and Lmenthol permeation enhancers on transdermal delivery of quercetin[J] Pharm Dev Technol，2007， 12（5）： 481

[6]Potts R O， Guy R H Predicting skin permeability[J] Pharm Res，1992， 9（5）： 663

[7]Moss G， Dearden J， Patel H， et al Quantitative structurepermeability relationships（QSPRs） for percutaneous absorption[J]. Toxicol In Vitro，2002， 16（3）： 299

[8]Wang J Y， Lan Y， Li H， et al Percutaneous penetration enhancement effect of essential oil of Mint（Mentha haplocalyx Briq） on Chinese herbal components with different lipophilicity[J] J Tradit Chin Med Sci，2014， 1（2）： 109

[9]王利胜，占建坤，周莉玲 高效液相色谱法测定跌打活络微乳中蛇床子素的含量[J] 时珍国医国药，2006，17（1）： 2

[10]高丽萍，蔡金花，何辉辉，等 HPLC法测定川芎嗪的平衡溶解度和表观油水分配系数[J] 海峡药学，2013，25（6）： 24

[11]杨银花，赵博琛，兰颐，等 当归酚酸类成分提取，富集工艺研究[J] 北京中医药大学学报，2013，36（9）： 627

[12]张超 氮酮对骨平巴布膏中葛根素体外透皮吸收的影响[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（6）： 1

[13]孙敏捷，游伟良，张杰，等 京尼平苷乳膏的制备和稳定性考察[J] 中国药学杂志，2013，48（6）： 455

[14]兰颐，王琼，安静，等 不同接受液对药物体外透皮试验的影响[J] 中国实验方剂学杂志，2013，19（13）： 7

[15]Williams A C， Barry B W Penetration Enhancers[J] Adv Drug Deliv Rev，2012， 64： 128

[16]Suhonen T M， Bouwstra J A， Urtti A Chemical enhancement of percutaneous absorption in relation to stratum corneum structural alterations[J] J Control Release，1999， 59（2）： 149

[17]Zhang C F， Yang Z L， Luo J B， et al Effects of cinnamene enhancers on transdermal delivery of ligustrazine hydrochloride[J] Euro J Pharm Biopharm，2007， 67（2）： 413

[18]Lan Y， Wu Q， Mao Y Q， et al Cytotoxicity and enhancement activity of essential oil from Zanthoxylum bungeanum Maxim as a natural transdermal penetration enhancer[J] J Zhejiang Univ Sci B，2014， 15（2）： 153

[19]Lan Y， Li H， Chen Y Y， et al Essential oil from Zanthoxylum bungeanum Maxim and its main components used as transdermal penetration enhancers： a comparative study[J] J Zhejiang Univ Sci B， 2014， 15（11）： 940

[责任编辑曹阳阳]