均匀设计优化荷叶半仿生提取工艺

郑丹丹，刘丽娜，王京龙，王占一，邓艳美

(枣庄学院生命科学学院，山东枣庄　277160)



均匀设计优化荷叶半仿生提取工艺

郑丹丹，刘丽娜，王京龙*，王占一，邓艳美

(枣庄学院生命科学学院，山东枣庄277160)

[摘要]采用均匀设计法优选荷叶半仿生提取的最佳工艺条件.本研究以荷叶主要有效成分总黄酮得率以及干浸膏得率为评价指标，对荷叶的半仿生提取工艺条件进行优选，考察三煎pH、提取总时间对荷叶总黄酮提取率的影响，采用分光光度法测定总黄酮的含量.通过优化实验并结合生产实际，确定荷叶半仿生提取的最佳工艺为3煎pH依次为3.5、6.5、9.0，3煎时间依次为2.0 h、1.5 h、1.5 h，所得荷叶总黄酮的提取率为9.7%.本法操作简便，提取率较高，为荷叶总黄酮提取工艺的改进提供了理论依据.

[关键词]半仿生提取；总黄酮；干浸膏；均匀设计

0引言

荷叶(Nelumbinis Folium)，系睡莲科莲属多年生草本植物莲(Nelumbo nuciferra Gaertn.)的叶片.广泛分布在长江、黄河和珠江等三大流域.荷叶具有清热解暑、升发清阳、凉血止血的功效，可用于暑热烦渴、暑湿泄泻、便血便漏[1].荷叶中的主要药效成分为黄酮类及生物碱类化合物[2-3].研究表明，黄酮类物质具有很高的生物活性，如抗氧化、抑菌、降血脂、减肥作用等[4].

常用的提取黄酮类化合物的方法有溶剂提取法[5-6]、机械化学法[7]、微波提取法[8]、超声波提取法[9]、超临界流体萃取法[10]、酶解法等.半仿生提取法(Semi-bionic Extraction Method，SBE)这一中药提取新技术坚持“有成分论,不唯成分论,重在机体的药效学反应”的基本原则,从生物药剂学角度模拟口服药物在胃肠道的转运过程,为口服给药制剂提供了一种新的提取方法[11].

目前半仿生提取法已成功应用于杜仲叶黄酮、葛根黄酮、苦参黄酮[12]、大黄[13]、连翘[14]、栀子[15]等的提取,笔者尚未见用此法提取荷叶黄酮的研究报道.本研究采用半仿生法提取荷叶黄酮，以总黄酮得率，干浸膏得率作为综合评价指标，通过均匀设计法考察不同因素和水平对提取工艺的影响，以期筛选最优提取工艺，为进一步高效利用荷叶有限资源提供理论依据.

1仪器与材料

1.1仪器

UV-2000紫外-可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)；HH-S4数显恒温水浴锅(常州普天仪器制造有限公司)；RE52CS-2旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D Ⅲ循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；FA1104电子分析天平(上海科学仪器有限公司)；DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司).

1.2材料

荷叶，购于山东省枣庄市市中区，产地浙江省，经枣庄学院王京龙老师鉴定为睡莲科植物莲(Nelumbo nuciferra Gaertn.)的干燥叶，芦丁(批号100080-200306)购于中国药品生物制品检验所，浓盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝等试剂均为分析纯.

2方法与结果

2.1荷叶总黄酮半仿生提取方法

2.1.1荷叶的预处理

将荷叶用自来水洗净后再用蒸馏水洗2次，置于80 ℃干燥箱中烘干，然后将烘干的荷叶剪成约0.5 cm2小片，干燥保存，备用.

2.1.2样本液的制备

称取荷叶25.0 g，共9份，按均匀设计U9(91×33)表(中国航天工业总公司第三研究院提供)，确定煎煮用水的pH值和煎煮总时间为考察因素.各因素水平分别为：第一煎水的pH值为2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、6.00，第二煎水的pH值为6.50、7.00、7.50，第三煎水的pH值为8.00、8.50、9.00，煎煮总时间为2.00 h、3.50 h、5.00 h.具体实验方案见表1.加入不同pH的水，然后常压下加热回流提取3次.三煎用水量依次为药材量的10、8、8倍,第一煎溶剂的pH用HCl，第二、第三煎溶剂的pH用NaOH溶液调整；三煎温度为水浴控温98 ℃，三煎水的pH及提取时间按照表2规定，分别将3煎提取液经致密筛网过滤，真空抽滤，收集滤液，滤液经旋转蒸发仪浓缩，合并，定容到250 mL，即得样品溶液A1～9号(质量浓度为100 mg/mL).

表1　U9(91×33)试验设计表

注：煎煮总时间列中，3煎时间分配为2.0 h(1.0 h、0.5 h、0.5 h)，3.5 h(1.5 h、1.0 h、1.0 h)，5.0 h(2.0 h、1.5 h、1.5 h).

2.2含量测定

2.2.1对照品溶液的配制

精密称取芦丁对照品10 mg，置50mL容量瓶中，以无水乙醇超声溶解，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得.

2.2.2芦丁标准曲线的绘制

精确量取2.2.1项下对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分别置于25 mL容量瓶中，各加水至6 mL,加5%亚硝酸钠溶液1 mL,使混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠10 mL,再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，用紫外-可见分光光度计，在500 nm处分别测定上述系列浓度标准溶液的吸光度，以芦丁质量浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线(如图1所示)，并求得标准曲线的回归方程及线性相关系数.

图1　芦丁标准曲线

线性回归方程y=10.609x-0.0059，R2=0.9996，说明在芦丁浓度为0.008～0.048 mg/mL的范围内，芦丁浓度与吸光度成线性关系，且线性关系非常好.

2.2.3精密度考察

精密量取2.2.1项下对照品溶液2.0 mL，按2.2.2项下方法，连续测定5次，计算得RSD为0.478%，结果表明该测定方法精密度良好.

2.2.4稳定性考察

精密量取2.2.1项下对照品溶液2.0 mL，按2.2.2项下方法，分别于0、2、4、6、8、12 h测定芦丁含量，计算RSD为0.993%(n=6)，证明该测定法测定过程中样品稳定性良好.

2.2.5重复性考察

称取荷叶25.0 g，按2.1.2项下方法制备样本液，精密量取2.0 mL，置25 mL量瓶中，照2.2.2项下操作，自“加水至6 mL”起，依法测定吸光度，计算6次平行测定结果的RSD值为1.281%，说明该含量测定方法的重复性良好.

2.2.6回收率考察

精密称取荷叶25.0 g，与适量芦丁对照品混合，按2.1.2项下方法，制备样本液，按2.2.2项下方法测定，计算回收率，平均回收率为104.7%(n=6，RSD=1.33%)，回收率满足含量测定的要求.

2.2.7总黄酮含量测定

精密吸取2.1.2项下的样品液A1～9各1 mL，用蒸馏水定容至25 mL，得供试液B1～9(质量浓度4 mg/mL).为了减少偶然误差，采用平行对照方法，分别精确吸取供试液B1～93、4、5 mL于25 mL容量瓶中，按照2.2.2项下方法进行显色，用空白的NaNO2·A1(NO3)3·NaOH溶液调零[16]，在500 nm波长处测其吸光度，依照下式计算总黄酮得率，进而求出每组的总黄酮平均得率.

式中，CA/(mg/mL)为由吸光度值带入芦丁标准曲线方程计算所得的黄酮浓度；CB/(mg/mL)为供试液浓度；V/(mL)为移取的供试液的体积；

2.2.8干浸膏得率的测定

精密量取A1～A9号样品液各20.0 mL，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘干至恒重，计算干浸膏得率[14].

2.3均匀设计数据处理

表2　各指标得率、标准化处理及综合评判

2.4工艺条件的优选

将表3-2及表4-2中Y值用SPSS软件进行回归分析处理，得回归方程：Y=2.546X2-9.555X1X1-4.842X3X3+0.537X4X4+13.103X1X3-4.784X1X4-17.275X2X4+20.958X3X4-162.276(X1、X2、X3分别为第一煎、第二煎、第三煎的pH，X4为提取总时间).回归方程显著性水平P<0.01，回归方程变量间关系是极显著的.相关系数r=0.9999，说明回归方程拟合效果极好.再进行规划求解，得到优化结果.优化结果为X1=3.5345，X2=6.5，X3=9，X4=5，预测值为43.3227.

2.5优化条件的验证

按2.1项下优化的提取方法，2.2项下含量测定方法，2.3项下数据处理方法，做3份验证性试验，见表3.

表3　验证试验结果

结果表明,验证试验综合评价值与优选结果Y值基本一致，表明优化条件可行，总黄酮得率均值为9.7%(n=3，RSD=0.5%).

3讨论

荷叶作为常用中药材，在减肥降脂方面一直有着独特的作用.本实验采用混合均匀设计法，以总黄酮、干浸膏得率为指标，对荷叶半仿生提取法(SBE法)的工艺条件进行了优化.

结合生产实际，确定荷叶的半仿生提取工艺条件为：3煎用水的pH依次为3.5、6.5、9.0；3煎时间依次为2 h、1.5 h、1.5 h.验证试验结果也表明，荷叶的总黄酮提取率达到9.7%(总黄酮质量/原药材质量)，提取效率较高.

半仿生提取法是基于灰思维模式，模拟人体胃肠道环境，采用连续的酸、碱溶剂进行提取的一种新提取技术[11].在指标选取时，既重视单体成分，又兼顾有效部位和活性混合物，综合评判，体现了中医药整体观念.

按照半仿生提取法的“有成分论，不唯成分论，重在机体药效学反应”基本研究思路，在后期的工作中，还要进一步将半仿生提取法(SBE)与普通水提取法(WE)、醇提取法(AE)进行提取效率的比较，并进行相关的药效学实验.

参考文献

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[责任编辑：闫昕]

Optimization of Semi-Bionic Extraction Process of Lotus Leaf by Uniform Design

ZHENG Dan-dan, LIU Li-na, WANG Jing-long*, WANG Zhan-yi, DENG Yan-mei

(College of Life Sciences, Zaozhuang University, Zaozhuang 277160, China)

Abstract:Uniform design was used to optimize semi-bionic extraction (SBE) process of Lotus leaf. The optimum process conditions of semi-bionic extraction of Lotus leaf were studied with total flavonoids and dried extract weight as the index. Besides, effects of the pH value and extraction time of the three-time extraction were investigated. Spectrophotography method was conducted to determine the content of total flavonoids. Combined with the industrial production practice, the optimal extraction process was as follows: pH value of water in the three-time extraction was 3.5, 6.5 and 9.0, with the extraction time of 2.0 h, 1.5 h and 1.5h, respectively. The obtained method was easy and simple to operate and the extract rate of total flavonoids was relatively high, which provided a theoretical basis for the extraction optimization of Lotus leaf.

Key words:semi-bionic extraction; total flavonoids; dried extraction; uniform design

[中图分类号]O657.32

[文献标识码]A

[文章编号]1004-7077(2016)02-0092-05

[作者简介]郑丹丹(1989- )，女，山东枣庄人，枣庄学院生命科学学院助教，硕士研究生，主要从事中药制剂新剂型与新技术的研究.王京龙(1988- )，男，山东济南人，枣庄学院生命科学学院讲师，博士研究生，主要从事中药新药研发与炮制原理的研究.

[收稿日期]2016-01-20