四种重楼皂苷对结肠癌细胞的体外毒性作用比较

庞晓辉，王朝杰，史祖宣，崔瑶，崔永霞，高天慧(河南省人民医院，郑州450000)



四种重楼皂苷对结肠癌细胞的体外毒性作用比较

庞晓辉，王朝杰，史祖宣，崔瑶，崔永霞，高天慧(河南省人民医院，郑州450000)

摘要：目的探讨重楼皂苷Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、H对结肠癌细胞的体外毒性，为寻求有效的结肠癌化疗药物提供依据。方法 选取复苏结肠癌细胞系SW620、SW480、Colo320、Lovo，将其与重楼皂苷Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、H、奥沙利铂等药物共培养48 h，加CCK-8孵育2 h，酶标仪检测450 nm处吸光度值。采用SPSS23.0统计软件分析重楼皂苷对结肠癌细胞的毒性。Annexin V/PI染色，流式细胞仪检测凋亡细胞。Western blotting法检测Bax、Caspase-3蛋白表达。结果重楼皂苷Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、H对结肠癌细胞系SW620、SW480、Colo320、Lovo抗肿瘤活性均良好。四种重楼皂苷单体对结肠癌细胞IC(50)值波动于0.4～8 mg/L。重楼皂苷I和重楼皂苷V对结肠癌细胞的毒性强于另外两种重楼皂苷单体(P<0.05)。重楼皂苷I(IC(50)值波动在0.4～0.6 mg/L)与奥沙利铂(IC(50)值0.1～2.1 mg/L)体外抗肿瘤作用相当。流式细胞仪显示重楼皂苷I处理的细胞Annexin V/PI阳性细胞比例升高52.3%，Western blotting结果显示重楼皂苷I处理的细胞Bax和Caspase-3蛋白表达分别是对照组的3倍和1.13倍。结论 重楼皂苷Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、H对结肠癌细胞均有良好的抗肿瘤活性，其中以重楼皂苷I作用最强，其能介导结肠癌细胞凋亡。

关键词：结肠癌；重楼皂苷；细胞凋亡

结直肠癌是发病率较高的恶性肿瘤，占胃肠道恶性肿瘤的第1位。GLOBOCAN发布2012年全世界结直肠癌发病率报告显示，2012年全世界有136.1万例新发结肠癌患者，69.4万例患者因此而病逝。而中国2012年有25.3万例新发病例，13.9万例患者因此而病逝[1]。化疗为晚期结肠癌的主要治疗手段。目前，结直肠癌患者主要的化疗药物有氟尿嘧啶、奥沙利铂[2]、伊立替康[3,4]等药物，然而，研究证实这两大系列化疗方案的一线有效率均在50%左右。首次化疗的结肠癌患者中近一半患者对目前标准化疗方案耐药[2～4]。当患者病情出现进展而更换化疗方案时，二线化疗方案的有效率在10%左右甚至更低。药理实验表明，重楼皂苷具有抗癌[6～9]、抗微生物、调节免疫止血、抑菌及镇痛和镇静等多种生理活性。研究认为，重楼皂苷抗肿瘤的作用机理在于其能介导肿瘤细胞变性坏死[7]和凋亡[10, 11]，亦有研究认为其能通过抑制细胞DNA和蛋白质的生物合成来达到抗肿瘤作用[6]。这个作用在肝癌[12]、宫颈癌[13]、肺癌[14]、乳腺癌[15]等细胞中均得到证实。虽然目前对重楼研究较多，但尚无比较不同重楼皂苷单体对结肠癌细胞毒性作用的报道。2013年11月～2015年2月，我们选用四个研究较多的重楼皂苷，采用CCK-8实验检测其对四种结肠癌细胞株的毒性作用，从而探讨重楼提取物对结肠癌细胞的毒性及抗肿瘤活性较强的重楼提取物。

1材料与方法

1.1材料狭叶重楼药材于2004年6月采自四川省天全县两路乡，经作者做原植物定为狭叶重楼P.polyphylla. Smith v ar stenophylla Franch。由四川大学药学院生药学教研室提供。提取物经HPLC鉴定，纯度均为95%。人结肠癌SW620、SW480、Colo320、Lovo细胞由河南省人民医院中心实验室所保存。Hyclone澳大利亚新生胎牛血清购自郑州四季生物技术有限公司；RPMI1640、DMEM干粉培养基购自GIBCO公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜( DMSO) 购于美国Sigma 公司；CCK-8购自日本同仁化学研究所，Annexin V/PI 购自Takara公司，Bax、Caspasse-3、β-actin购自Epitomics公司 。实验所用酶标仪购自Bio-rad公司。

1.2细胞复苏与培养将冻存管取出，立即放入37～40 ℃温水中不断摇晃，使冰冻的细胞液在30 s内解冻，移入无菌离心管，SW620、SW480、Colo320、Lovo细胞中加入含10%胎牛血清的RPMI1640(SW620、Colo320、Lovo)或DMEM(SW480)高糖培养液10 mL轻轻吹打成悬液，1 000 r/min离心5 min，吸弃上清液，加入含10%胎牛血清RPMI1640或DMEM高糖培养液4 mL，轻轻吹打成悬液，种入75 mL培养瓶，置于37 ℃ 含5%CO2饱和湿度孵箱培养，次日可见细胞贴壁生长，换液。3～5 d长满瓶底80%，用0.25%胰蛋白酶消化传代。传代后每2～3 d换液1次，取对数生长期细胞为实验对象。

1.3细胞存活率测算采用CCK-8法。本实验设阴性对照组、奥沙利铂组及重楼组。实验传代时，按5×103细胞/孔密度分至96孔板，待其贴壁进入对数生长期后，更换培养基,分别加入不同浓度的药物(奥沙利铂组、重楼组、DMSO)。阴性对照组加与奥沙利铂组及重楼组相应浓度的DMSO；奥沙利铂组加入含奥沙利铂的培养基，使其终浓度达到0.1、0.5、1、2、4、8、16 mg /L；重楼组分别加含重楼皂苷(Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、H)的培养基，使其终浓度达到0.1、0.5、1、2、4、8、16 mg/L。每个浓度设置4个复孔。以上细胞加药培养48 h后加入10 μL的CCK-8，孵箱孵育2 h后放入酶标仪进行测定。检测450 nm处的吸光度值。该实验重复3 次。细胞存活率(%)=[化合物组A450]/ [未加药组A450-空白对照组A450]×100%。其中化合物组A450为具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的吸光度值；空白对照组A450为具有CCK-8溶液和培养基没有药物和细胞孔的吸光度值；未加药组A450为具有细胞、CCK-8溶液的吸光度值。

1.4细胞凋亡检测细胞传代时，取1×106的SW480细胞分装两瓶分别作为实验组和对照组，培养24 h，贴壁并进入对数生长期后，实验组加1 mg /L的重楼皂苷I，对照组加同样浓度的DMSO。37 ℃含5%CO2饱和湿度孵箱培养24 h后，收集培养基和细胞：悬浮细胞直接收集到离心管中，而贴壁细胞消化使之脱壁，500～1 000 r/min离心5 min弃去培养液。用孵育缓冲液洗3次，500～1 000 r/min离心5 min。用100 mL Annexin V/PI重悬细胞，室温下避光孵育10～15 min。避光并不时振动。上流式细胞仪检测。流式细胞仪检测细胞中Annexin V/PI阳性细胞值。

1.5细胞凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3表达检测采用Western blotting法。 细胞传代时，取1×106个SW480细胞分装两瓶分别作为实验组和对照组培养24 h，贴壁并进入对数生长期后，实验组加0.8 mg /L的重楼皂苷I，对照组加同样浓度的DMSO。收集对数生长期细胞，用50～100 μL三去污裂解液重悬细胞，反复吹打3～5 min。混匀后于4 ℃温育20 min，12 000 g离心20 min，取上清作为细胞总蛋白质，紫外分光光度法测定蛋白含量。取蛋白样品20 μg，进行12%SDS-PAGE，转移至PVDF膜，以5%脱脂奶粉封闭2 h，加入1%脱脂奶粉稀释的抗Bax、Caspase-3、β-actin的抗体(1∶1 000)4 ℃过夜，TBST洗涤3次，加入二抗(1∶1 000)，室温轻摇2 h，最后用红外荧光扫描成像系统显色。为进一步验证重楼皂苷I是否能介导肿瘤细胞凋亡，我们采用SW480细胞，加重楼皂苷I培养48 h(对照组加同样浓度的DMSO)，提取细胞总蛋白，Western blotting法检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3蛋白表达。

1.6统计学方法采用SPSS23.0统计软件。计算IC50值，采用GraphPad Prism软件制作细胞存活率曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1重楼皂苷对结肠癌细胞的毒性作用重楼提取物Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、H对结肠癌细胞Lovo、SW620、SW480、Colo320均有一定毒性。采用SPSS23.0软件计算出来的IC50值显示，四种重楼皂苷单体对结肠癌细胞显示出剂量依赖性毒性，表现出良好的抗肿瘤活性。具体如表1所示。不同浓度重楼皂苷对结肠癌细胞作用曲线如图1所示。随着重楼皂苷浓度的增加，其对结肠癌细胞的毒性作用增加。四种重楼皂苷对结肠癌细胞IC50值波动在0.4～8 mg/L。重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ对结肠癌细胞的毒性强于另外两种重楼皂苷单体。其中重楼皂苷I对结肠癌细胞的毒性作用最强，其IC50值波动在0.4～0.6 mg/L，重楼皂苷V IC50值波动在1～2.5 mg/L；重楼皂苷Ⅵ IC50值波动在1.7～3.5 mg/L；重楼皂苷H的IC50值波动在2.2～8 mg/L。结肠癌常用的化疗药物奥沙利铂IC50值波动在0.1～2.1 mg/L。除外SW620细胞外，重楼皂苷I和V在2 mg/L的浓度下对结肠癌细胞的毒性均优于奥沙利铂，表现出良好的抗肿瘤特性。不同重楼皂苷对结肠癌细胞的毒性作用不同，重楼皂苷I对结肠癌的毒性与奥沙利铂差异无统计学意义(P<0.05)，毒性作用较强的重楼皂苷I对结肠癌细胞抗肿瘤作用与奥沙利铂相当。重楼皂苷Ⅰ和Ⅴ不仅表现出对结肠癌细胞具有较低的抑制浓度，同时在稍大剂量(如1～4 mg/L)时能杀灭大部分肿瘤细胞,其作用优于奥沙利铂。奥沙利铂虽对结肠癌细胞有较低的IC50值，但在较大浓度的奥沙利铂下仍有相当部分结肠癌细胞存活。见图1。研究过程中对结肠癌细胞观察发现，在结肠癌细胞中加入重楼皂苷48 h后，光镜下肿瘤细胞皱缩，出芽，崩解破裂等，呈现出凋亡征象。

表1　　　　四种重楼皂苷单体及奥沙利铂对结肠癌细胞的

图1　Lovo、SW620、SW480、Colo320细胞加重楼皂苷Ⅰ、Ⅵ、H、Ⅴ奥沙利铂等药物后的存活率曲线

2.2结肠癌细胞凋亡情况实验中通过观察加药后细胞的状态发现贴壁培养的细胞形态变小变圆，甚至部分脱落。遂采用Annexin V/PI双染色，流式细胞仪检测Annexin V与PI阳性细胞比例来了解细胞凋亡情况。研究显示，加重楼皂苷Ⅰ培养后的SW480结肠癌细胞Annexin V/PI阳性的细胞值明显升高(增高52.3%)，而对照组加DMSO细胞几乎无凋亡细胞，见图2。

2.3细胞凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3表达重楼皂苷Ⅰ加药培养后细胞中Bax蛋白明显升高(为对照组的3倍)，Caspase-3蛋白略有升高(为对照组的1.13倍)。

注：A、B分别为SW480细胞加DMSO和重楼皂苷Ⅰ后。

图2加入DMSO和重楼皂苷Ⅰ后SW480细胞周期

3讨论

结肠癌是人类发病率和病死率均较高的恶性肿瘤之一，目前结肠癌的主要治疗方法有化疗、放疗、分子靶向治疗等。化疗是结肠癌的主要治疗手段，但研究发现结肠癌患者一线化疗的有效率仅50%左右，二线化疗的有效率仅10%左右，尚无有效的三线化疗方案。寻找对结肠癌患者有效的治疗药物成为目前研究发展趋势。

植物类抗肿瘤药物是目前的研究方向。重楼是其中之一[5]，重楼又名七叶一枝花，为延龄草科重楼属植物华重楼滇重楼的干燥根茎。对其化学成分分析表明，重楼属植物所含甾体皂苷为其主要的化学成分[1]。重楼所含的甾体皂苷类化合物为其药效物质基础。近来研究发现，重楼抗肿瘤能通过阻断肿瘤内新生血管生成达到抗肿瘤作用。其不仅能抗肿瘤，同时能逆转肿瘤耐药[16]。重楼杀伤肿瘤细胞的机制在于诱导肿瘤细胞凋亡[10,11]。重楼皂苷是重楼提取物，具有良好的抗癌作用。虽然迄今为止对重楼皂苷的研究较多，且其显示出对胃、结肠、卵巢等肿瘤均有良好的抗肿瘤作用，然而并没有对比不同重楼皂苷单体对结肠癌的抗肿瘤作用方面的研究。本研究目的在于通过研究4种纯化的重楼皂苷单体对结肠癌细胞的体外抗肿瘤特性来筛选可能对结肠癌具有良好抗肿瘤作用的重楼皂苷，为其进一步临床应用提供理论指导。

本研究结果显示，四种重楼皂苷单体(Ⅰ、Ⅵ、H、Ⅴ)均显示出对结肠癌细胞良好的体外抗肿瘤作用。与目前常用的抗肿瘤药物奥沙利铂相比，重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ均对结肠癌细胞具有较强的抗肿瘤特性，重楼皂苷Ⅰ抗肿瘤特性可与奥沙利铂相媲美。其具有较低的IC50值并在2 mg/L左右能抑制80%～90%的肿瘤细胞。而临床上常用的奥沙利铂虽有较低的IC50值对肿瘤细胞生长有一定抑制作用，但其对诱导结肠癌细胞凋亡方面的作用明显劣于重楼皂苷Ⅰ。在实验过程中对肿瘤细胞观察发现，药物处理细胞48 h后，肿瘤细胞出现明显变小、皱缩、出芽等现象，呈现出凋亡征象。而奥沙利铂组细胞则明显少于重楼皂苷组细胞。Western blotting和流式细胞仪检测凋亡细胞均进一步证实重楼皂苷Ⅰ能通过介导肿瘤细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用。这与部分研究认为重楼皂苷能介导肿瘤细胞凋亡相吻合。本研究进一步研究发现重楼皂苷同样能逆转结肠癌细胞耐药。这些研究证据揭示重楼皂苷具有成为有效抗结肠癌药物的潜力。然而本研究仅局限于体外研究，未进行相应的动物实验及人体毒理、药物代谢动力学、人体抗肿瘤作用等方面的研究。本研究课题组将继续进行其抗肿瘤作用机制、体内抗肿瘤作用及其对结肠癌细胞奥沙利铂耐药方面的研究。参考文献：

[1] IARC. GLOBOCAN 2012: Estimated cancer incidenee, mortality and prevalence worldwide in 2012. (2013-12-1) [2014-1-20]. http://globocan. iarc. Fr/Default. aspx

[2] Tournigand CT, Andre E, Achille G, et al. FOLFIRI followed by FOLFOX6 or the reverse sequence in advanced colorectal cancer: a randomized GERCOR study[J]. J Clin Oncol, 2004,22(2):229-237.

[3] Morton CL, Wadkins RM, Danks MK, et al. The anticancer prodrug CPT-11 is a potent inhibitor of acetylcholinesterase but is rapidly catalyzed to SN-38 by butyrylcholinesterase[J]. Cancer Res, 1999,59(7):1458-1463.

[4] Pommier Y. Topoisomerase I inhibitors: camptothecins and beyond[J]. Nature Reviews Cancer, 2006,6(10):789-802.

[5] Yang QX, Yang CR. Cytotoxic steroidal saponins from Polygonatum punctatum[J]. Chem Biodivers, 2006,3(12):1349-1355.

[6] 石小枫,杜德极.重楼皂苷对动物移植性肿瘤细胞核酸和蛋白质生物合成的影响[J].中药药理与临床,1988,4(4):30.

[7] 陈清,阎姝.重楼的药理作用及其毒性反应的研究进展[J].医药导报,2012,31(7):886-888.

[8] 刘银花,王跃华,何新友,等.重楼愈伤组织的抑菌作用研究[J].成都大学学报(自然科学版),2015,34(1):12-15.

[9] Yan LL, Zhang YJ, Gao WY, et al. In vitro and in vivo anticancer activity of steroid saponins of Paris polyphylla var. Yunnanensis[J]. Exp Oncol, 2009,31(1):27-32.

[10] Ong RC, Lei J, Lee RK, et al. Polyphyllin D induces mitochondrial fragmentation and acts directly on the mitochondria to induce apoptosis in drug-resistant HepG2 cells[J]. Cancer Lett, 2008,261(2):158-164.

[11] Siu FM, Ma DL, Cheung YW, et al. Proteomic and transcriptomic study on the action of a cytotoxic saponin (Polyphyllin D): induction of endoplasmic reticulum stress and mitochondria-mediated apoptotic pathways[J]. Proteomics, 2008,8(15):3105-3117.

[12] Cheung, JY, Ong RC, Suen YK, et al. Polyphyllin D is a potent apoptosis inducer in drug-resistant HepG2 cells[J]. Cancer Lett, 2005,217(2):203-211.

[13] Fernandez-Herrera MA, Lopez-Munoz H, Hernandez-Vazquez JM, et al. Synthesis of 26-hydroxy-22-oxocholestanic frameworks from diosgenin and hecogenin and their in vitro antiproliferative and apoptotic activity on human cervical cancer CaSki cells[J]. Bioorg Med Chem, 2010,18(7):2474-2484.

[14] Kong M, Fan J, Dong A, et al. Effects of polyphyllin I on growth inhibition of human non-small lung cancer cells and in xenograft[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2010,42(11):827-833.

[15] Lee MS, Yuet-Wa JC, Kong SK, et al. Effects of polyphyllin D, a steroidal saponin in Paris polyphylla, in growth inhibition of human breast cancer cells and in xenograft[J]. Cancer Biol Ther, 2005,4(11):1248-1254.

[16] Nguyen VT, Darbour N, Bayet C, et al. Selective modulation of P-glycoprotein activity by steroidal saponines from Paris polyphylla[J]. Fitoterapia, 2009,80(1):39-42.

In vitro toxicity of four kinds of polyphyllins on colon cancer cells

PANGXiaohui,WANGChaojie,SHIZuxuan,CUIYao,CUIYongxia,GAOTianhui

(HenanProvincialPeople'sHospital,Zhengzhou450000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the in vitro toxicity of polyphyllins I, V, VI and H on colon cancer cells and to provide guidance for seeking effective chemotherapy drugs of colon cancer.MethodsThe resurgent SW620, SW480, Colo320, Lovo colon adenocarcinoma cell lines were co-cultured with polyphyllin I, polyphyllin VI, polyphyllin H, polyphyllin V and oxaliplatin for 48 h respectively, which were then added with CCK-8 for two-hour incubation. The optical density at 450 nm was detected by microplate reader.The cytotoxicity of polyphyllin on colon cancer cells was analyzed by SPSS23.0. Annexin V/PI staining and flow cytometry was used to detect the apoptotic cells. Western blotting was applied to detect Bax and Caspase-3 protein expression.ResultsThe polyphyllin I, polyphyllin VI, polyphyllin H and polyphyllin V showed remarkable antineoplastic activity on SW620, SW480, Colo320 and Lovo cell lines with IC(50) of 0.4 mg/L to 8 mg/L. The anticancer activity of polyphyllin I and polyphyllin V were stronger than that of polyphyllin VI and polyphyllin H (P<0.05). The in vitro anti-tumor effect of polyphyllin I with IC(50) of 0.4-0.6 mg/L was the same as oxaliplatin with IC(50) of 0.1-2.1 mg/L. Flow cytometry demonstrated that the percentage of Annexin V/PI positive cells treated with polyphyllin I increased 52.3%. Western blotting showing that polyphyllin I mediated expression of Bax and Caspase-3 in colorectal cells was 3 and 1.13 times higher than that of the control group.ConclusionPolyphyllin I, polyphyllin VI, polyphyllin H and polyphyllin V show good anticancer activity against colon adenocarcinoma cell lines in vitro, especially polyphyllin I which can mediate the apoptosis of colon cancer cells.

Key words:colorectal carcinoma; polyphyllin; apoptosis

(收稿日期：2016-01-05)

中图分类号：R735.35

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)13-0013-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.005

通信作者简介：高天慧(1970-)，女，主任医师，博士，主要研究方向为恶性肿瘤肿瘤的临床诊治。E-mail:gaotianhui123456@163.com

第一作者简介：庞晓辉(1983-)，女，住院医师，博士，主要研究方向为恶性肿瘤肿瘤的临床诊治。E-mail:pangxh0321@163.com