RAD50、CDHR3、CYP27B1基因多态性与儿童哮喘易感性的关系

于美丽,马兆越(烟台毓璜顶医院,山东烟台64000；日照市人民医院)



RAD50、CDHR3、CYP27B1基因多态性与儿童哮喘易感性的关系

于美丽1,马兆越2(1烟台毓璜顶医院,山东烟台264000；2日照市人民医院)

摘要：目的探讨RAD50、CDHR3、CYP27B1基因多态性与儿童哮喘发病风险的关系。方法 采用病例-对照的研究方法，对入组的80例哮喘儿童(哮喘组)和80例健康儿童(对照组)应用质谱SNP技术，研究RAD50基因位点rs6871536、CDHR3基因位点rs 6967330、CYP27B1基因位点rs10877012的单核苷酸多态性，计算其基因型频率和等位基因频率，并分析基因位点的多态性与儿童哮喘发病风险间的关系。结果哮喘组与对照组rs6871536位点基因型及等位基因频率差异均有统计学意义(P均<0.05)；哮喘组与对照组rs6967330、rs10877012基因型比较差异无统计学意义(P均>0.05)。突变等位基因C、T与哮喘有相关性，TT、CC型的OR(95%CI)分别为0.407(0.231～0.718)、0.677(0.546～0.839)。结论 RAD50基因rs6871536位点多态性可能与儿童哮喘相关；CDHR3基因rs 6967330位点多态性和CYP27B1基因位点rs10877012位点多态性可能与儿童哮喘无相关性。

关键词：哮喘；基因多态性；RAD50；CDHR3；CYP27B1

支气管哮喘(简称哮喘)是一种常见病、多发病，尤其是在儿童人群之中，其发病率与病死率不断上升。目前支气管哮喘的发病原因及机制尚未完全明确，但众多学者们认为支气管哮喘是一种由环境因素和遗传因素共同参与的Ⅰ型超敏反应性疾病[1]。随着社会的进步，遗传学与分子生物学的不断成熟，人们将对疾病病因研究的重点逐渐聚焦到基因水平，哮喘是一种多基因复杂性疾病，近年来有关哮喘易感基因的研究越来越多[2～5]。CDHR3基因、CYP27B1基因、RAD50基因是近年来众多专家较为关注的与哮喘易感性相关的基因。2013年3月～2014年10月,我们选取CDHR3基因rs 6967330位点、CYP27B1基因位点rs10877012、RAD50基因rs6871536位点进行多态性研究，以期为哮喘的预防与治疗提供新的思路。

1资料与方法

1.1临床资料哮喘患儿80例(哮喘组)，男49例、女31例，年龄(7.94±2.11)岁。哮喘患儿均符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》诊断标准[6]。同时收集在烟台毓璜顶医院儿科门诊体检中心体检的健康儿童80例为对照组，男43例、女37例，年龄(8.23±2.17)岁。对照组儿童及三代以内直系亲属均无哮喘病史及典型的过敏性疾病病史。两组研究对象均来自烟台地区，相互间无血缘关系。两组对象均为汉族，性别、年龄构成差异均无统计学意义。

1.2RAD50、CDHR3、CYP27B1基因多态性检测方法对哮喘患儿及健康儿童均采集肘静脉血3 mL，3 000 r/min离心5 min，分离血清后置于EP管中，然后严格按照血液基因组DNA提取试剂盒说明进行DNA提取，试剂盒来自北京天根生化科技有限公司。根据文献，在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上查询包括相应位点的一段基因序列，确定其突变位点后进行引物设计，该过程由北京六合华大基因科技有限公司深圳分公司完成。

1.3统计学方法采用SPSS16.0统计软件。经校正性别和年龄的影响后，计算每个SNP位点的基因型和等位基因频率分布，Hardy-Weinberg平衡检测用精确检验，哮喘组和对照组基因型和等位基因频率分布比较采用卡方检验，采用Logistic回归分析来计算其OR和95%CI。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

在校正性别和年龄的影响后，经精确检验，哮喘组与对照组CDHR3、CYP27B1、RAD50基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0．05)，表明其基因频率已达到遗传平衡，具有群体代表性。

经统计学分析，RAD50位点rs6871536、CDHR3位点rs 6967330、CYP27B1位点rs10877012的基因型与等位基因频率分布分别见表1、2、3。哮喘组与对照组CDHR3位点rs 6967330和CYP27B1位点rs 10877012的基因型及等位基因频率差异无统计学意义(χ2=2.209，P=0.363；χ2=2.737，P=0.254)。哮喘组与对照组RAD50位点rs6871536位点基因型及等位基因频率差异均有统计学意义(χ2=7.931，P=0.019；χ2=9.986，P=0.002)，突变等位基因C、T与哮喘有相关性，TT、CC型的OR(95%CI)分别为0.407(0.231～0.718)、0.677(0.546～0.839)。

表1　两组rs6871536 位点基因型与等位基因频率比较[例(%)]

表2　两组rs6967330位点基因型与等位基因频率比较[例(%)]

表3　两组rs10877012位点基因型与等位基因频率比较[例(%)]

3讨论

支气管哮喘是一种多基因参与的复杂性疾病，具有高度明显的遗传性[7]。有研究发现，如果父亲或母亲一方患有支气管哮喘，孩子患哮喘的危险程度比无哮喘家庭的孩子高，如果父母均患有哮喘，则孩子患病的风险更大[8]。目前支气管哮喘的发病率与病死率不断上升，发现与哮喘相关的易感基因，深入研究其发病机理，可为哮喘的预防和治疗提供新的靶点。

支气管哮喘是一种Ⅰ型变态反应性疾病，在特异性抗原的刺激下，IgE与肥大细胞、嗜酸性、嗜碱性粒细胞上的特异性受体结合后，释放大量的炎症介质，引起支气管平滑肌的痉挛，毛细血管通透性增加等变态反应，最终导致哮喘的发生[9]。第三次全基因组关联分析新发现了一个与总IgE相关的基因-RAD50[10]，该基因位于染色体的5q31.1区域，这一区域与白细胞介素等与哮喘相关的细胞因子基因区域接近[11]。RAD50是一种DNA修复蛋白，能与DNA结合并能检测其有缺陷的部位，其能调控相邻的几个白细胞介素基因的表达[12]。本研究我们选择RAD50基因的rs6871536 位点作为研究对象，探讨烟台地区RAD50基因多态性和支气管哮喘发病危险性间的关系，结果显示在哮喘组和对照组中，rs6871536 位点的基因型和等位基因型频率比较差异有统计学意义，表明RAD50基因rs6871536 位点的多态性可能与烟台地区的儿童支气管哮喘发病风险有关。

已有研究[13]发现，钙黏蛋白家族如上皮细胞钙黏蛋白、原钙黏素介导的细胞受体等与支气管哮喘有明显的相关性。哥本哈根大学进行的一项研究，通过筛查儿童的DNA，发现了在极早期哮喘形成中起重要作用的基因-CDHR3，该基因定位于染色体的7q22.3区域,是最新发现与支气管哮喘发病风险有关的基因[14]。CDHR3是一种包含六个外钙黏蛋白结构域的跨膜蛋白，其可介导同源性细胞的黏附，参与细胞分化、细胞间相互作用等过程[15]。其中钙黏蛋白结构域D5与D6间的两个半胱氨酸529和566由于与这两个结构域的距离较短，相互之间的作用会使二硫键发生重组，形成野生型的半胱氨酸突变体[14]。该变体的残基有可能会破坏蛋白质的结构及稳定性，因此这可能是CDHR3参与支气管哮喘发病的主要机制。rs6967330位点位于CDHR3基因的最顶端，由于半胱氨酸529的等位基因发生了A-G突变，导致基因序列和基因型均发生了变化，该位置编码的氨基酸由半胱氨酸突变成了酪氨酸。本研究结果发现，在哮喘组和对照组中，CDHR3基因rs6967330位点的基因型和等位基因型频率的分布差异无统计学意义，表明CDHR3基因rs6967330位点的多态性与烟台地区儿童支气管哮喘的易感性无明显相关性。

近年来，越来越多的研究表明维生素D与支气管哮喘间存在明显相关性[16]。但维生素D必须转化为其活性形式1,25二羟维生素D3才能发挥其生物学作用[17]。1α羟化酶是维生素D活化过程中的关键酶，由CYP27B1编码。染色体的12q13.1-13.3区域是CYP27B1基因的所在位置，位于启动子区域的基因位点rs10877012可发生G-T突变，导致该基因的序列发生改变，进而影响CYP27B1基因的表达，体内1,25(OH)2D3的水平发生改变，导致与维生素D缺乏有关的疾病如支气管哮喘等的发生。本研究结果表明，rs10877012位点与支气管哮喘的发病风险间无明显相关性，这可能是由于该位点的G-T突变为同种意义的突变，基因的表达并未受到影响。

参考文献：

[1] Cookson W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy[J]. Nature, 1999,402(9)：5-11.

[2] White JH， Chiano M， Wigglesworth M， et al． Identification of a novel asthma susceptibility gene on chromosome 1 qter and its functional evaluation[J]． Hum Mol Genet， 2008，17(13)：1890-1903．

[3] Zhang Y， Leaves NI， Anderson GG， et al． Positional cloning of aquantitative trait locus on chromosome 13q14 that influences immunoglobulin E levels and asthma[J]． Nat Genet， 2003，34(2)：181-186．

[4] Noguehi E， Yokouchi Y， Zhang J， et al． Positional identification of all asthma susceptibility gene off human chromosome 5q33[J]． Am J Respir Crit Care Med， 2005，172(2)：183-188．

[5] Laitinen T， Polvi A， Rydman P， et al． Characterization of a common susceptibility loeus for asthma-related tmits[J]． Science， 2004，304(5668)：300-304．

[6] 中华医学会儿科学分会呼吸学组,《中华儿科杂志》缡辑委员会.儿童支气管哮喘诊断与防治指南[J].中华儿科杂志，2008,46(10)：745-753.

[7] Burke W, Fesinmeyer M, Reed K, et al. Family history as a predictor of asthma risk[J]. Am J Prev Med， 2003，24(2):160-169.

[8] 曲政海，林荣军，孙向红.儿童支气管哮喘[M].北京：人民出版社，2014:2-7.

[9] Galli SJ, Kalesnikof J， Grimbaldeston MA, et al． Mast cells as"tunable"effector and immunoregulatory cells：recent advances[J]． Annu Rev Immunol, 2005,23(7)：749-786.

[10] Weidinger S, Gieger C, Rodriguez E, et al. Genome-wide scan on total serum IgE levels identifies FCER1A as novel susceptibility locus[J]. PLoS Genet, 2008,4(8)：e1000166.

[11] Lee GR, Fields PE, Griffin TJ, et al. Regulation of the Tp cytokine locus by a locus control region[J]. Immunity, 2003,19(1):145-153.

[12] Li X, Howard TD, Zheng SL. Genome-wide association study of asthma identifies RAD50-IL13 and HLA-DR/DQ regions[J]. J Allergy Clin Immunol, 2010,125(2)：328-335.

[13] Nawijn MC, Hackett TL, Postma DS， et al. E-cadherin: gatekeeper of airway mucosa and allergic sensitization[J]. Trends Immunol, 2011,32(6):248-255.

[14] Hulpiau P, van Roy F. Molecular evolution of the cadherin superfamily[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2009,41(2):349-369.

[15] Bønnelykke K, Sleiman P, Nielsen K, et al. A genome-wide association study identifies CDHR3 as a susceptibility locus for early childhood asthma with severe exacerbations[J]. Nat Genet, 2014,46(1):51-55.

[16] 董建军，毕连红.小儿支气管哮喘的临床分析[J].中国综合临床,2012,28(z1)：90-91.

[17] Wang TJ， Zhang F， Richards JB， et al． Common genetic determinams of vitamin D insufficiency：a genome-wide association study[J]． Lancet, 2010,376(3)：180-188．

(收稿日期：2015-11-27)

中图分类号：R256.12

文献标志码：B

文章编号：1002-266X(2016)13-0059-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.023