熊果酸对糖尿病大鼠肾组织的保护作用

陈雪品，成曦爽，涂画，石亚静，吕志伟，齐亚娟,2，韩淑英,2 (华北理工大学，河北唐山 063000；2河北省慢性疾病重点实验室暨唐山市慢性病临床基础研究重点实验室)



熊果酸对糖尿病大鼠肾组织的保护作用

陈雪品1，成曦爽1，涂画1，石亚静1，吕志伟1，齐亚娟1,2，韩淑英1,2(1华北理工大学，河北唐山 063000；2河北省慢性疾病重点实验室暨唐山市慢性病临床基础研究重点实验室)

摘要：目的观察熊果酸对糖尿病大鼠肾组织的保护作用。方法将45只SD大鼠随机分为对照组(NC组，8只)、造模组(37只)。造模组以高脂饲料喂养4周和一次性尾静脉注射链脲佐菌素(30 mg/kg)制备糖尿病大鼠模型。将造模成功的32只大鼠随机分为模型对照组(MC组)、二甲双胍组(MF组)、熊果酸高剂量组(UrAH组)及熊果酸低剂量组(UrAL组)。MF组按100 mg/kg灌胃二甲双胍，UrAH组按100 mg/kg灌胃熊果酸，UrAL组按50 mg/kg灌胃熊果酸，MC组与NC组每天灌胃同体积纯水，每天1次，连续6周。分别于给药前及给药第2、4、6周测定各组大鼠血糖，给药6周后测定各组大鼠血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)，取双侧肾脏称重并计算肾脏系数，釆用HE染色法在光镜下观察大鼠肾组织病理变化。结果与NC组大鼠相比，MC组大鼠肾组织病理损伤重，肾系数大(P<0.01)，血清UA、BUN、Scr水平高(P均<0.01)。与MC组相比，MF组、UrAH组大鼠肾脏病变减轻，肾系数小(P均<0.05)，血清UA、BUN、Scr水平低(P<0.05或<0.01)。结论熊果酸对糖尿病大鼠肾组织有一定的保护作用。

关键词：熊果酸；糖尿病；糖尿病肾病

糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者最严重的慢性并发症之一，更是引起终末期肾脏病变的首要因素[1]。DN典型的病理特点为微循环障碍和微血管基底膜增厚[2]。在我国，糖尿病的发病率逐年上升[3]，寻求一种有效治疗DN的药物已成为研究的热点。熊果酸是一种五环三萜酸类化合物，广泛存在于栀子、白花蛇舌草、女贞子、山楂等药用植物中，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎等多种生物学效应[4]。近年来，文献[5]报道，熊果酸有治疗糖尿病的潜在活性，并证实了熊果酸是通过保护糖尿病大鼠的胰岛B细胞来降低血糖水平的。但熊果酸是否对糖尿病大鼠肾组织有保护作用尚不清楚，本实验旨在对此进行探讨。

1材料与方法

1.1实验动物雄性SPF级SD大鼠45只，体质量230～260 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004。大鼠维持饲料购于北京科澳协力饲料有限公司，合格证号：SCXK(京)2014-0010。高脂饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2014-0008。

1.2仪器与试剂罗氏血糖仪及试纸(瑞士罗氏诊断有限公司)。链脲佐菌素(STZ)购自西格玛奥德里奇公司；熊果酸(中国药品生物制品鉴定所)；盐酸二甲双胍片(天津亚宝药业科技有限公司)；尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)试剂盒购自北京瑞正善达生物工程技术有限公司；水合氯醛(西安藻露堂药业集团康复医药有限公司)；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3大鼠糖尿病模型的制备及熊果酸用法所有SD大鼠适应性喂养1周后随机分为对照组(NC组，8只)、造模组(37只)。对照组给予普通饲料喂养，造模组给予高脂饲料喂养，所有大鼠自由饮水、进食。高脂饲料喂养4周后，禁食不禁水16 h，造模组尾静脉注射STZ(用pH 4.5的0.1 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠溶液配成1.5%浓度)30 mg/kg,2 mL/kg尾静脉注射。STZ注射1周后，所有大鼠禁食不禁水12 h，取尾静脉血检测随机血糖(非禁食上午8:00)，连续3次随机血糖值≥16.7 mmol/L为造模成功。35只大鼠造模成功，剔除体质量较低或血糖过高的3只大鼠，剩余32只，按随机数字表法将其分为模型对照组(MC组)、二甲双胍组(MF组)、熊果酸高剂量组(UrAH组)及熊果酸低剂量组(UrAL组)。MF组按100 mg/kg灌胃二甲双胍，UrAH组按100 mg/kg灌胃熊果酸，UrAL组按50 mg/kg灌胃熊果酸，MC组与NC组每天灌胃同体积纯水。各组均在上午8:00～10:00点灌胃给药，每天1次，连续6周。

1.4观察方法给药期间观察各组大鼠一般状态。分别于给药前及给药第2、4、6周用血糖仪测定随机血糖(上午给药后30 min)1次。给药6周后禁食12 h，大鼠用10%水合氯醛以3 mL/kg腹腔注射麻醉，经腹主动脉取血并分离血清，静置2 h后，3 000 r/min离心20 min，取上层血清于EP管中，并存放于-80 ℃冰箱中备用。用全自动生化分析仪测定血清UA、BUN、Scr。大鼠取血后，立即剖腹取双侧肾脏(剥离肾脏周围脂肪)，用滤纸吸干肾脏表面血液后称重，计算肾脏系数，肾脏系数=双侧肾脏质量(mg)/体质量(g)。肾脏称重后迅速固定于4%多聚甲醛中，取出肾脏，冲洗，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片后，HE染色，于OLYMPUS BX50高倍显微镜下观察组织形态改变并用病理图像分析系统记录和拍照。

2结果

除NC组外，其他各组大鼠自造模之日起均出现多饮、多食、多尿、体质量减轻症状，精神萎靡，反应迟钝，毛发光泽度降低。各组大鼠血糖水平比较见表1。各组大鼠血清Scr、BUN、UA水平及肾脏系数比较见表2。HE染色结果显示，NC组肾组织形态正常，肾小球形态规则，肾小管排列紧密，结构清晰，肾小管上皮细胞形态无异常改变。MC组大鼠肾小球体积增大，基底膜不完整；肾间质有炎细胞浸润及纤维组织的增生，肾小管上皮细胞明显水肿。UrAH组肾小球形态结构改变明显减轻，肾间质仅有少量炎细胞浸润及纤维组织的增生，肾小管上皮细胞轻度水肿。MF组肾组织病理改与UrAH组相近。UrAL组肾组织形态结构改变轻于MC组，肾间质有散在炎症细胞浸润及纤维组织的增生，肾小管上皮细胞中度水肿。

3讨论

高血糖是引起糖尿病微血管并发症的根本原因,血糖控制效果不佳的患者，肾脏的病变发展相对更快[6,7]。肾脏长期处于高血糖水平，通过糖基化终末产物的形成，促进氧化应激，进一步激活细胞内的信号转导通路，导致肾组织损伤，加剧DN的发生发展[8,9]。

表1　各组大鼠血糖水平比较

注：与NC组比较，△P<0.05，▲P<0.01；与MC组比较，*P<0.05，#P<0.01。

表2　　　　各组大鼠血清Scr、BUN、UA水平

注：与NC组比较，△P<0.05，▲P<0.01；与MC组比较，*P<0.05，#P<0.01。

有文献[11]指出,微炎症状态也与糖尿病及糖尿病肾损伤有密切联系，寻找一种有效控制糖尿病肾损伤及其炎症反应的药物，已成为临床研究的焦点。熊果酸可改善糖尿病及其并发症症状[10,11]。熊果酸可以通过增加肝糖原形成，从而降低血糖水平[12]。另外，熊果酸也能抑制糖尿病诱导肾皮质中的诱导型一氧化氮合成酶过表达，用来治疗糖尿病性肾病变[13]。因此，为进一步研究熊果酸对糖尿病大鼠肾损伤的抑制作用，我们采用30 mg/kg剂量的STZ大鼠尾静脉注射的方法成功制备了糖尿病大鼠模型。本研究结果表明，MC组大鼠血清Scr、BUN、UA水平均升高，肾组织病变明显，这些现象都说明糖尿病大鼠己出现早期的DN症状。UrAH治疗组血清Scr、BUN、UA和随机血糖均降低，肾脏系数减小，说明熊果酸可使肾组织病变减轻，从而保护受损的肾功能，延缓DN的进展。肾组织病理切片亦表明，100 mg/kg熊果酸能减轻糖尿病大鼠肾损伤，治疗效果与二甲双胍相当。

可见，熊果酸能通过降低血糖，纠正糖尿病大鼠的糖代谢紊乱，改善肾小管间质纤维化及炎症反应，从而发挥保护肾脏的作用，其确切机制有待进一步研究。

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(收稿日期：2015-11-17)

中图分类号：R587

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)11-0028-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.010

通信作者：韩淑英(E-mail: shuyinghan59@126.com)

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81471022)；国家级大学生创新实验计划项目(201510081006)；华北理工大学大学生创新实验计划项目(X2015006)。