北疆地区结核分枝杆菌基因分型及耐药性分析

包海洋 曹旭东 秦莲花 杨华 吴长新 刘忠华 陈创夫



·论著·

北疆地区结核分枝杆菌基因分型及耐药性分析

包海洋 曹旭东 秦莲花 杨华 吴长新 刘忠华 陈创夫

目的 对北疆地区结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型和耐药性检测，研究不同基因型在该地区的流行及耐药性。 方法 收集北疆地区114株结核分枝杆菌临床分离株，采用间隔区寡核苷酸和多位点可变串联重复序列(VNTR)技术进行基因分型，应用NTsys 2.10e软件对结果进行聚类分析，比例法检测临床分离株的耐药性。 结果 114株临床分离株，间隔区寡核苷酸分型结果和RD105缺失检测法结果共同显示北京基因型占62.28%(71/114)、非北京基因型占37.72%(43/114)。分2大簇(A和B)：A簇有34株，北京基因型占11.77%(4/34)，非北京基因型占88.23%(30/34)；B簇有80株，北京基因型占83.75%(67/80)，非北京基因型占16.25%(13/80)。耐药显示：总耐药率为40.35%(46/114)，耐多药(MDR)率为19.30%(22/114)；北京基因型耐药率为42.25%(30/71)，非北京基因型的耐药率为37.21%(16/43)，差异无统计学意义(χ2=0.28，P=0.60)。其中，北京基因型MDR耐药菌株占22.54%(16/71)结论 北疆地区北京基因型和非北京基因型的耐药率没有差异，但MDR菌株流行主要是由北京基因型引起的。

分枝杆菌，结核； 基因型； 抗药性，细菌

结核病作为一种古老的疾病仍在危害着人类的健康，结核分枝杆菌耐药株的出现及广泛流行给结核病的防控带来了极大困难。随着分子生物学的发展，可变串联重复序列(variable number tandem repeat, VNTR)和间隔区寡核苷酸分型技术因其操作简单、快速，以及数据易于统计和重复性高等特点，使其在结核分枝杆菌分型中被广泛应用，也使人们能更好地了解结核分枝杆菌的流行情况[1-4]。2010年第五次结核病流行病学抽样调查表明，活动性、痰涂片阳性结核病患病率全国分别是459/10万、66/10万；新疆则分别是1526/10万、196/10万。新疆地区总耐药率为36.00%，总耐多药率(MDR)为1.20%；以链霉素(Sm)和异烟肼(INH)耐药最为常见[5-6]。本研究利用VNTR和间隔区寡核苷酸分型技术对北疆地区结核分枝杆菌菌株进行分型，研究北京基因型和非北京基因型在北疆地区的流行情况，并且研究各基因型的耐药性，尤其是耐多药结核病在北疆地区耐药结核病中所占比例，为北疆地区结核病的防控提供理论依据。

材料和方法

一、菌株来源

H37Rv标准株由新疆人畜共患病实验室提供。2013年2月至2014年6月，从新疆胸科医院和石河子市第二人民医院收治的结核病患者的痰、支气管灌洗液、胸腔积液、感染部位脓液中分离了114株结核分枝杆菌临床分离菌株，并经对硝基苯甲酸(PNB)培养基和噻吩-2-羧酸酰肼(TCH)培养基培养鉴定；其中男71例，女43例；≤20岁1例，20～岁41例，40～岁35例，≥60岁37例。

二、主要实验试剂

2×Taq PCR Master Mix、核酸染料均购自天根生物科技有限公司；分型所用引物由华大基因合成。

三、 菌株DNA制备

采用常规7H9液体培养基培养菌株，待菌株生长到对数期，从培养基中吸取1 ml菌液置于1.5 ml EP管(Eppendorf公司生产)中，80 ℃灭活1 h，8000×g离心5 min,弃上清后再加入50 μl DNA裂解液,99 ℃水浴10 min，-20 ℃保存备用。

四、PCR反应

参考国内外相关文献报道中多态性较高的VNTR分型位点，确定7个VNTR分型位点miru10、miru16、miru23、miru26、miru27、miru39、miru40，其标准株H37Rv的扩增片段大小和重复片段大小及引物序列见表1[1-4]。

PCR扩增反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，61 ℃复性30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。采用2×Taq PCR Master Mix便捷式PCR试剂盒，各个位点的上下游引物终浓度均为0.2 μmol/L。

五、VNTR位点组合对菌株分辨力评价和成簇率分析

采用Hunter-Gaston指数(Hunter-Gaston diversity index，HGDI)评价不同VNTR位点组合的辨别能力[4]，公式如下：

N:实验菌株总数；S：分型中实验菌株不同基因型的数目；nj：第j个基因型的菌株数。

采用成簇率计算公式来计算7位点组合的成簇情况，公式如下：

成簇率=(NC-C)/N

Nc为成簇的总分离菌株数，C为簇数，N为总分离菌株数。

表1 7个VNTR重复区重复片段大小及引物序列

图1 北疆结核分枝杆菌临床分离菌株部分间隔区寡核苷酸分型图谱

六、北京基因型和非北京基因型的测定

间隔区寡核苷酸分型方法见参考文献[7]。采用RD105 缺失基因检测法鉴定北京基因型菌株, 引物设计和PCR反应体系见参考文献[8]。

七、耐药性试验

采用比例法对菌株进行链霉素(Sm)、异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB) 4种抗结核药物的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)。4种药物在罗氏(L-J)培养基中的终浓度分别为4.0、 0.2、40.0、2.0 μg/ml。

耐药标准：含药培养基菌落数/对照培养基菌落数≥1%为耐药。

八、数据分析

基因分型的数据在Microsoft Excel电子表格中表述为二进制格式，用NTsys 2.10e软件进行聚类分析。耐药数据统计分析采用卡方检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、北京基因型和非北京基因型测定结果

间隔区寡核苷酸分型检测结果：114株菌株中北京基因型71株，占62.28%；非北京基因型43株，占37.32%；部分结果见图1。

为了验证间隔区寡核苷酸分型准确性，采用RD105缺失基因检测法测定北京基因型(部分结果见图2)。结果114株菌株中北京基因型71株，占62.28%；非北京基因型43株，占37.32%。两种检测方法结果完全一致。

菌株若为北京基因型则可以扩增出284 bp的目的片段，若为非北京基因型则该片段缺失图2 RD105缺失基因检测法测定北京基因型

二、VNTR分型结果

采用7个基因位点对所收集的114株临床株进行VNTR分型，分析不同基因位点的基因多态性，7个位点总分辨率指数(HGDI)为0.95，其中miru26位点分辨率指数最高(为0.73)，miru23位点分辨率指数最低(为0.04)。并且根据每株菌所对应的分型位点拷贝数用NTsys 2.10e软件进行分析，并建立进化树(图3)。VNTR结果分析得到66个基因型，无独特型基因型，共有33个簇，成簇菌株有82株，成簇率为71.9% (82/114)。菌株被分成A、B两大簇：A簇有34株，北京基因型占11.8%(4/34)，非北京基因型占88.2%(30/34)；B簇有80株，北京基因型占83.8%(67/80)，非北京基因型占16.3%(13/80)。

MLVA：多位点可变数目串联重复序列分析图3 114株结核分枝杆菌临床株VNTR分型进化树

三、 耐药性结果

114株临床株总耐药率为40.35%(46/114)，其中4种抗结核一线药的耐药率分别为：Sm 28.95% (33/114)，INH 29.82%(34/114)，RFP 25.44%(29/114)，EMB 9.65%(11/114)(图4A)。结果显示新疆北疆地区耐药结核分枝杆菌流行菌株耐药以耐多药为主，但多耐药率为19.30%(22/114)占有较高比例(图4B)。

图4 114株结核分枝杆菌临床分离株的耐药情况

四、北疆结核分枝杆菌VNTR分型结果和耐药性之间的关系

对流行菌群进行耐药性分析，发现北京基因型耐药率为42.25%(30/71)，非北京基因型耐药率为37.21%(16/43)，两者差异无统计学意义(表2)；北京基因型MDR率为22.54%(16/71)，非北京基因型MDR率为13.95%(6/43)，MDR菌株流行主要是北京基因型引起的(表3)。

讨 论

本研究所收集的菌株为新疆自治区胸科医院和石河子第二人民医院不间断连续收集。患者来自北

疆地区的主要市、县及农村地区。有文献报道新疆地区结核分枝杆菌以北京基因型为主，占菌株总数的68.72%，非北京基因型占菌株总数的31.28%[4]。本研究结果显示，114株临床分离菌株中北京基因型占62.28%，非北京基因型占37.72%。结合文献报道和本研究结果，北疆地区流行的结核分枝杆菌以北京基因型为主。VNTR分型中miru26位点分辨率最高，为0.73；而miru39分辨率最低，为0.04。其中miru26位点分辨率与浙江、安徽等地区相近[9-10]，由于这个位点对北疆地区菌株具有较高分辨率，所以可以作为北疆地区结核分枝杆菌分型的主要位点。

近年来，由北京基因型耐药引起的结核病暴发及流行使北京基因型与耐药性成为人们的研究热点。有文献报道，新疆地区北京基因型结核分枝杆菌的耐药率远高于非北京型[11]。本研究显示，北疆地区临床分离株北京基因型结核分枝杆菌耐药率为42.25%、非北京基因型结核分枝杆菌耐药率为37.21%，仍然以北京基因型为主，但非北京基因型结核分枝杆菌耐药率也较高，两者差异无统计学意义。同时，对北京基因型结核分枝杆菌耐药菌株分析发现，北京基因型结核分枝杆菌的MDR率为22.54%(16/71)，显示北疆地区MDR菌株流行主要是北京基因型结核分枝杆菌。目前MDR患者的治疗需要5～6种抗结核药物配合使用，疗程长，而且大多采用的是疗效较差、副作用大的二线药，部分MDR患者甚至没有有效的治疗方案，提示北疆地区对MDR防控的严峻性。

表2 北京基因型和非北京基因型的耐药及MDR例数比较分析

表3 A、B簇菌株中北京基因型和非北京基因型耐药及MDR分析

为了预防和控制MDR，必须从源头清除结核分枝杆菌耐药的产生，国内外已经证实DOTS策略是预防和控制MDR产生的最佳措施，美国、古巴等地区在推行DOTS措施后，对于预防和控制MDR的成效明显。所以，北疆地区的结核病尤其是MDR结核病的防治工作还需进一步加强和完善。

由于本研究收集样本的时间短，样本量少，并且局限于北疆地区，因此有一定的局限性，并不能代表整个新疆地区的流行情况。南疆喀什地区的耐药结核病研究表明，南疆地区结核分枝杆菌耐药率略低于本研究的耐药率[12]，由于仅限于喀什地区，所以后期研究主要是扩大南疆地区及全疆重点地区人群的结核病患者结核分枝杆菌临床分离株的收集和分析，以期全面地研究新疆结核感染的流行情况。

新疆位于我国西北部，地域广阔，经济发展与东部地区相比较缓慢，医疗水平的落后和对结核病认识的欠缺，导致结核病在新疆地区呈现高发态势[13-14]。北疆地区属于人口相对稠密地区，做好北疆地区的结核分枝杆菌分型和耐药检测工作，对于控制北疆地区结核病的传播、预防及治疗具有重大意义。

志谢 感谢新疆胸科医院和新疆石河子第二人民医院的专家为本研究提供了菌株和相应的指导；同济大学附属上海市肺科医院 上海市结核(肺)重点实验室提供研究平台，以及实验室各位专家的悉心指导和帮助

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(本文编辑：范永德)

Genotyping and drug resistance analysis ofMycobacteriumtuberculosisin the northern regions of Xinjiang province

BAOHai-yang*,CAOXu-dong,QINLian-hua,YANGHua,WUChang-xin,LIUZhong-hua,CHENChuang-fu.

*CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China

s:CHENChuang-fu,Email:ccf-xb@163.com;LIUZhong-hua,Email:nllzh@126.com

Objective To study the relationship between different genotypes and drug-resistance inMycobacteriumtuberculosisand analyze molecular epidemiological characteristics. Methods One hundred and fourteenMycobacteriumtuberculosisclinical isolates were collected in the northern regions of Xinjiang province. Their genotypes were analyzed by spoligotyping and drug susceptibility was assessed using the proportion method. NTsys 2.10e software was used to perform cluster analysis. Results There were 66 different genotypes among the 114Mycobacteriumtuberculosisisolates. Seventy-one (62.28%) isolates belonged to the Beijing genotype and 43 (37.72%) to non-Beijing genotypes. The isolates divided into two clusters (A and B), with 34 in the A cluster, 11.77% (4/34) of which were Beijing genotypes, 88.23% (30/34) of which were non-Beijing genotypes; 80 in the B cluster, of which 83.75% (67/80) were Beijing genotype isolates, and 16.25% (13/80) were Beijing genotypes. The drug-resistance rate among the 114Mycobacteriumtuberculosisisolates was 40.35% (46/114), with 19.3% (22/114) of the isolates being multidrug resistance (MDR). The drug-resistance rate of Beijing genotype isolates was 42.25% (30/71), while that of non-Beijing genotype isolates was 37.21% (16/43) (χ2=0.28,P=0.60). Of the drug-resistant Beijing genotype isolates, 22.54% (16/71) were multidrug resistant. ConclusionMycobacteriumtuberculosisisolates from the northern regions of Xinjiang province showed marked polymorphisms, with the main epidemic genotype being the Beijing genotype. Both Beijing and non-Beijing genotypes showed significantly high rates of drug-resistance.

Mycobacteriumtuberculosis; Genotype; Drug resistance, bacterial

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.02.008

国家自然科学基金(81201253,31060333)；上海市卫生局课题(20124200)；“十二五”国家科技重大专项(2013ZX10003003-002)；国家科技部重大专项(2012CB518706)

832003 新疆维吾尔自治区石河子大学动物科技学院(包海洋、陈创夫)，医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室(曹旭东、吴长新)；同济大学附属上海市肺科医院 上海市结核病(肺)重点实验室(秦莲花、杨华、刘忠华)

陈创夫，Email：ccf-xb@163.com；刘忠华，Email：nllzh@126.com

2015-09-11)