酸枣仁提取物对失眠小鼠脑内DA、NE的影响①

王　影，蔡栋梁，黄佳滨

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003)



酸枣仁提取物对失眠小鼠脑内DA、NE的影响①

王影，蔡栋梁，黄佳滨

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003)

摘要:目的:研究酸枣仁提取物对失眠小鼠脑组织内多巴胺(DA)和盐酸去甲肾上腺素(NE)的影响。方法:通过测定戊巴比妥钠小鼠入睡潜伏期、戊巴比妥钠小鼠睡眠时间、小鼠直接睡眠时间及“失望”小鼠不动时间对酸枣仁提取物进行药效学研究;通过测定小鼠脑组织内DA和NE的含量。结果:酸枣仁提取物低剂量组、高剂量组均能缩短戊巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期，与空白对照组比较有显著性差异(P＜0.05) ;高剂量组能降低小鼠脑组织内DA、NE含量，增加戊巴比妥钠小鼠入睡率并延长睡眠时间，增强小鼠的“失望”行为，与空白对照组比较有显著性差异(P＜0.05) ;结论:酸枣仁提取物安全性高，镇静安神效果显著，为新药临床实验研究提供了依据。

关键词:酸枣仁提取物; DA; NE

目前快速发展的经济社会，人们的生活水平不断提高，生活节奏也不断加快，各种压力也在增加，随之出现了失眠的症状，这样影响了人们的生活和工作，延误治疗可能会转化为慢性失眠或其他神经系统疾病［1］。因此，失眠症的治疗已成为当前医药界的研究热点。酸枣仁为李科枣属植物酸枣的种子经烘干而成。其具有敛汗生津、补肝养心安神之功效。主要用于心烦意乱，恶梦多梦，自汗等症的治疗。本文以中医药传统理论和现代药理研究为依据，应用现代技术和方法对酸枣仁提取物进行较深入的研究，为新药临床实验研究提供依据。

1　材料与方法

①仪器: TG16－WS高速低温离心机(湘仪离心机仪器有限公司) ; 960－MC荧光分光光度计(上海分析仪器总厂) ; FA－2004型电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司) ;数控超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司)。②试剂:戊巴比妥钠(中国医药集团上海化学试剂公司) ;地西泮注射液(天津金耀氨基酸有限公司) ;朱砂安神丸(药都制药集团股份有限公司) ;多巴胺标准品DA(Sigma公司)盐酸去甲肾上腺素标准品NE(Sigma公司) ;酸枣仁提取物(自制)。③实验动物:昆明种小鼠(佳木斯大学实验动物中心)。

1.2实验方法

1.2.1实验动物分组及给药

取昆明种小鼠56只，雌性28只，雄性28只，随机分为4组，每组14只。适应环境2d后，在第3天给药，空白作为对照组:灌服蒸馏水1.0mL;阳性对照组:灌服地西泮l.1mg·kg－1;低剂量样本组:灌服酸枣仁提取物8g·kg－1;高剂量样本组:灌服酸枣仁提取物20g·kg－1。每天一次，连续灌服7d。

1.2.2小鼠睡眠资料测定

观察末次给药后1.0h内各组小鼠入睡只数。小鼠放置于背卧位时，如大于40～60秒不能翻正者即为小鼠进入睡眠状态，以入睡小鼠只数为计数资料;末次给药60min后，将胶带纸固定鼠尾在距尾尖2.0cm处，固定处系一15cm 8号手术线，另一端固定在台架上，使小鼠头向下悬挂。小鼠有活动时不记录，小鼠活动不出现时开动秒表，观察7min，记录后6min内小鼠不动的时间。以小鼠不动时间为计量资料;末次给药60s后，给各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠，以刺激反射消失为指标，观察给予药物能否延长戊巴比妥钠的睡眠时间;各组小鼠腹腔注射阈下剂量戊巴比妥钠，记录30min内入睡小鼠数;于末次给药后25min后给各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠，把刺激反射消失作为检测指标，观察给予药物对戊巴比妥钠入睡潜伏期的影响。

1.2.3小鼠脑组织内DA、NE的含量测定

1.2.3.1脑组织样本处理

于末次给药1h后，处死小鼠，用剪刀剪开颅骨取出小鼠的小脑，用常温生理盐水冲洗小脑组织表面，用滤纸吸干水分，用天平称重后，放在带有刻度离心管中，搅拌匀浆，用零度酸化的正丁醇补足到4.5mL，振荡5min，离心5min(3000r·min－1)，取上清液2.5mL升置于另一带塞离心管内，加5mL正庚烷和0.1当量浓度盐酸1.2mL振荡8min，离心10min，溶液分为上下两层。取水相0.6mL，加入0.06摩尔pH7.2磷酸盐缓冲液1.6mL，碘液0.1mL，静置3min，加亚硫酸钠0.6mL，静置3min，加6当量浓度醋酸0.6mL，沸水浴25min，冷却后，在Ex: 365nm，Em: 480nm时测定NE荧光强度，加45%磷酸0.lmL，沸水浴25min后，在Ex: 310nm，Em: 370nm时测定DA荧光强度。

1.2.3.2标准品溶液处理

取标准液0.2mL置于带刻度离心管中封塞，按着“组织样品处理”方法进行操作。

1.2.3.3空白溶液处理

取重蒸馏水0.2mL，放在带刻度离心管中封塞，按着“组织样品处理”方法进行操作。

1.2.4计算公式:

1.3统计学方法

将测得的数据，采用t检验进行统计学分析。

2　结果

2.1小鼠直接睡眠实验结果

受试验小鼠在给予药物后，空白对照组和低剂量样本组小鼠活动自如，没有睡眠迹象，高剂量组的小鼠亦没有出现入睡迹象，而出现毛耸立、蜷缩、懒动，与空白对照组相比，阳性对照组小鼠入睡率为87.5%，有著性差异(P＜0.01) ;高、低剂量组小鼠入睡率为0.01，无显著性差异。可见酸枣仁提取物无论高剂量还是低剂量均不能提高小鼠直接睡眠的入睡率。见表1。

表1　小鼠直接睡眠资料结果统计(±s)

表1　小鼠直接睡眠资料结果统计(±s)

注:与空白对照组比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别　　不动时间(s)　　睡眠时间(min)　　潜伏期(min)空白对照组95.2±74.1　 23.4±17.3　 38.8±11.1阳性对照组　160.6±27.8*　81.3±12.2＊＊　21.9±6.0样品低剂量组　114.5±32.7　 29.5±20.5　 27.1±7.8*样品高剂量组　166.7±35.2*　50.8±19.0＊＊　22.7±7.3＊＊

2.2小鼠脑组织内DA、NE的含量测定

将测定DA结果进行t检验，与空白对照组比较，阳性对照组与样品高剂量组均能显著降低小鼠脑组织内DA含量(P＜0.05) ;将测定NE结果统计进行t检验，与空白对照组比较，阳性对照组与样品高剂量组均能显著降低小鼠脑组织内DA含量(P＜0.05)。见表2。

表2　样品含量测定(±s，n =14)

表2　样品含量测定(±s，n =14)

注:与空白对照组比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别　DA平均含量(g·kg－1)　 NE平均含量(g·kg－1)空白对照组1.46±0.99　0.95±0.3232阳性对照组　0.63±0.33*　0.4467±0.3822*样品低剂量组　1.26±0.71　0.7312±0.2302样品高剂量组　0.63±0.09*　0.4677±0.2581*

3　讨论

在药效学实验过程中采用随机化设计观察小鼠在给药前后的组间行为学差别，为减少误差，应选择安静温暖的环境进行实验，同时还要保证操作轻巧。小鼠脑组织组织内DA、NE提取液制备时，煮沸时间对DA和NE的荧光强度有影响，在15min，DA和NE的荧光强度随时间的延长分别增强和减弱;在15～25min，DA和NE的荧光强度稳定，因此，煮沸时间应选择在15～25min。本实验对失眠大鼠给予酸枣仁提取物，无论低剂量8g·kg－1、还是高剂量20g·kg－1均能缩短巴比妥钠小鼠入睡潜伏期，与空白对照组有显著性差异(P＜0.05)，给予高剂量酸枣仁提取物能降低戊巴比妥钠小鼠脑组织DA、NE的含量，增加了戊巴比妥那小鼠入睡率并延长睡眠时间，增强了小鼠的失望行为，而且与空白对照组比较均有显著性差异，充分表明酸枣仁提取物具有镇静安神、使用安全的功效，由此我们可以设想将酸枣仁提取物用于接近人类动物猴等动物身上，观察其对失眠猴等动物睡眠的影响，如同对戊巴比妥小鼠的作用效果，可以将其引入临床观察，为改善临床失眠患者的药物研究提供切实可行的实验依据。

参考文献:

［1］王欲天.酸枣仁安眠药物的制备及药效学研究［D］.山西大学2004届硕士研究生学位论文，2004，1

［2］张淑兰.失眠药物治疗研究进展［J］.中华中西医学杂志，2014，3 (12) : 51－52

［3］房海燕.加味安尔眠颗粒的研制［D］.山东中医药大学2006届硕士研究生学位论文，2006，2

［4］张敏.常见的几种睡眠障碍［J］.中国农村医学杂志，2013，6(5) : 12－13

［5］Krystal AD.The changing perspective on chronic insomnia management［J］.J Clinic Psychiatry，2014，65(8) : 20

［6］王心明，严明秀.引起睡眠障碍的常见原因［J］.中国社区医师，2012，18(14) : 15

(收稿日期:2015－10－26)

作者简介:王影(1964～)女，黑龙江佳木斯人，学士，主任医师。

基金项目:①佳木斯大学科学技术项目，编号: L2012－056。

中图分类号:R749.7+1

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－0023－02