口腔扁平苔藓患者血清差异蛋白表达检测及意义

刘健，刘铁军，安欣，李昆珊，贾楠，许彦枝

(河北医科大学第四医院，石家庄050011)

口腔扁平苔藓患者血清差异蛋白表达检测及意义

刘健，刘铁军，安欣，李昆珊，贾楠，许彦枝

(河北医科大学第四医院，石家庄050011)

目的 探讨口腔扁平苔藓(OLP)患者血清差异蛋白表达及意义。方法 选择6例OLP患者(观察组)和6例健康志愿者(对照组)，抽取空腹静脉血后采用苯酚抽提法提取血清蛋白，Bradford法测定蛋白含量，双向荧光差异凝胶电泳法分离检测差异蛋白点，液相色谱-质谱联用技术鉴定差异蛋白。选择其中研究较少的蛋白，采用Western blotting法检测两组蛋白相对表达量。结果 两组血清差异蛋白点(583±183)个，其中重复性好的蛋白差异点20个，质谱分析蛋白序列鉴定出12种蛋白质。12种蛋白质中，7种(补体C3、激肽原、α-2-巨球蛋白、人抗凝血酶Ⅲ、分泌型IgA、补体C9、β-1-金属结合球蛋白)在观察组血清中表达降低，5种(结合珠蛋白、铜蓝蛋白、载脂蛋白AⅠ、维生素D、人类因子B)表达升高。观察组血清补体C3和人抗凝血酶Ⅲ蛋白相对表达量均低于对照组，载脂蛋白AⅠ高于对照组(P均<0.01)。结论 OLP患者血清中存在12种差异蛋白质，血清补体C3和人抗凝血酶Ⅲ蛋白表达均降低，载脂蛋白AⅠ表达升高，其发病可能与免疫功能降低及感染有关。

口腔扁平苔藓；双向荧光差异凝胶电泳；蛋白质组；补体C3；载脂蛋白AⅠ；人抗凝血酶Ⅲ

蛋白质组学是以一个生物体内基因编码的所有蛋白质作为研究对象，对蛋白的结构和功能进行研究，以筛选与疾病有关的特异性生物标记物，有助于探索发病机制与治疗靶点[1，2]。双向凝胶电泳是最主要的蛋白质分离方法，但是不同电泳图谱间的差异对结果分析有很大影响。双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)可检测到蛋白样品间微小表达差异，具有更高的灵敏性、重复性、准确性[3～6]。目前2-D DIGE技术已广泛应用于国内外医学研究，对于鉴定与癌症相关的分子标记物具有重要意义[7]。口腔扁平苔藓(OLP)是一种有癌变倾向的口腔黏膜疾病，其发病机制不明。本研究采用2-D DIGE法及质谱技术筛选并鉴定与OLP发病有关的差异蛋白，为探讨其在OLP发生、发展过程中作用机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2011年9月～2013年12月我院收治的OLP患者6例(观察组)，均为女性，年龄50～60岁、平均55岁；患者均经临床及病理确诊，均未经系统治疗，病变主要位于两颊及前庭沟黏膜，以白色病变为主，无全身系统疾病。选择同期与观察组性别、年龄匹配的健康志愿者6例(对照组)，口腔内无黏膜病变，无中、重度牙周炎，入组前3个月内无用药史。本研究通过医院伦理委员会审查，研究对象均知情同意。

1.2 血清差异蛋白检测及鉴定

1.2.1 标本采集及血清蛋白提取 抽取两组清晨空腹静脉血3 mL，4 ℃条件下2 000 r/min离心15 min，取上清液分装于1.5 mL离心管中，-80 ℃冰箱保存待用。选择苯酚抽提法提取血清蛋白：将血清置于冰上融化解冻，加入水饱和苯酚沉淀蛋白，再加入缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0)及甲醇去除血清中的杂质及苯酚，得到蛋白沉淀，最后用DIGE buffer复溶蛋白。采用Bradford法[8]测定蛋白含量。

1.2.2 差异蛋白检测 采用2-D DIGE法。将符合标准的蛋白进行十二烷磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，检测各样品蛋白重复性及蛋白降解情况。将两组样品随机配成6对，每个样品取50 μg蛋白并用Cydye标记(3对用Cy3标记，3对用Cy5标记，正反标标记可得出的同一位置重复性高的差异点)。蛋白和荧光染料在冰上避光孵育2 h，加入1 μL Lysine(10 mmol/L)中止反应，每个样品再补充50 μg蛋白(每个样品共上样100 μg)。将每对样品混合，加入2-D DIGE buffer，采用24 cm、pH值为4～7的IPG胶条进行等电聚焦电泳(IEF)。电泳条件：水化2 h，50 V、10 h，500 V、1 h，1 000 V、1 h，8 000 V、1 h，10 000 V、10 h，至最终伏小时数≥80 000时终止电泳(此时电流应<50 μA)。IEF结束后，IPG胶条先后在含有1% DTT和4% IAA的平衡液中各自平衡15 min，然后进行SDS-PAGE。于50 V条件下缓慢电泳2 h，待样品进入分离胶后，将电压升至100 V过夜(操作及电泳过程中应注意避光)，至溴酚蓝的前沿到达胶的下沿时结束电泳。采用Typhoon 9410扫描仪对2-D DIGE蛋白胶进行扫描，建立彩色图谱，Deep Purple染色。选取背景较为清晰、重复性好的蛋白胶，采用DeCyderTM6.5差异分析软件搜索差异点,将差异表达量>1.2倍的蛋白质点进行标记。生成挖点坐标文件，导出后用Ettan spot picker挖点。

1.2.3 差异蛋白鉴定 采用液相色谱-质谱联用技术。对挖出的蛋白胶粒进行脱色、清洗、冻干，加入Trypsin溶液酶解，LTQ XL质谱仪鉴定。采用Bioworks Browser3.3.1软件，通过ESQUEST运算方法，在蛋白数据库(NCBI中的human fasta数据2013.12.10)搜索差异蛋白的酶解肽段，确定被测差异蛋白的名称。

1.2.4 差异蛋白相对表达量检测 采用Western blotting法。选择研究较少的差异蛋白(补体C3、人抗凝血酶Ⅲ及载脂蛋白AⅠ)，参照上法采用SDS-PAGE技术分别提取两组血清蛋白样品，常规恒流电泳，电转于硝基纤维素膜上，将膜置于封闭液中室温封闭90 min，加入所检测差异蛋白一抗(1∶10 000)，4 ℃孵育过夜。次日PBST洗膜3次×10 min，加入二抗羊抗兔IgG(1∶10 000)孵育2 h，PBST洗膜4次×10 min，然后进行化学发光反应。将化学发光试剂与膜蛋白充分接触，1 min后在Alpha innotech上扫描，曝光0.5～1 min。采用Image J软件检测差异蛋白图像灰度值，计算差异蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 差异蛋白检测与结果鉴定 SDS-PAGE显示各样品条带清晰，两组间蛋白条带重复性较好，无明显蛋白丢失现象。2-D DIGE检测出差异蛋白点(583±183)个，其中重复性好的蛋白差异点20个，质谱分析蛋白序列鉴定出12种差异蛋白质，见插页Ⅱ图2。12种蛋白质中，7种(补体C3、激肽原、α-2-巨球蛋白、人抗凝血酶Ⅲ、分泌型IgA、补体C9、β-1-金属结合球蛋白)在观察组血清中表达降低，5种(结合珠蛋白、铜蓝蛋白、载脂蛋白AⅠ、维生素D、人类因子B)表达升高，见表1。

表1 观察组血清中12种差异蛋白质鉴定结果

2.2 两组血清补体C3、人抗凝血酶Ⅲ及载脂蛋白AⅠ蛋白相对表达量比较 观察组血清补体C3和人抗凝血酶Ⅲ蛋白相对表达量均低于对照组，载脂蛋白AⅠ高于对照组(P均<0.01)，见表2。

表2 两组血清补体C3、人抗凝血酶Ⅲ及载脂蛋白AⅠ蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.01。

3 讨论

OLP是一种多因素相互作用的慢性口腔黏膜疾病，与多基因改变的级联反应有关，发病原因及机制不详[9～13]。前期研究中，我们应用基因芯片技术筛选出与OLP相关的差异表达基因，并分析其机制可能与感染、氨基酸代谢等8条通路有关，但无法全面了解基因转录，以及合成蛋白质后疾病发生、进展的机制[14]。王文梅等[15]采用蛋白质组学传统双向电泳-质谱分析技术建立OLP组织与口腔正常黏膜组织的蛋白表达谱，对OLP患者在双向电泳图谱中具有高表达差异的10个蛋白点进行质谱分析，发现了锰超氧化物歧化酶、膜联蛋白Ⅰ等差异表达蛋白。蒋红柳等[16]采用双向电泳技术发现了OLP 患者经羟氯喹治疗前后血清中的9个差异蛋白，为研究药物靶向治疗和细胞信号转导途径奠定基础。本研究应用2-D DIGE法筛选出OLP患者血清中的差异蛋白，并通过质谱分析蛋白序列鉴定出12种蛋白质；其中血清补体C3、载脂蛋白AⅠ、人抗凝血酶Ⅲ在OLP中的研究较少，对其蛋白表达进行免疫印迹法鉴定，发现与蛋白质组学检测结果一致。

补体系统广泛参与机体防御外来病原体的入侵以及免疫调节，补体C3是血清中含量最高的补体成分。替代激活途径是直接由C3开始的补体激活途径，其激活物质并非抗原抗体复合物，而是细菌的细胞壁成分——脂多糖，以及多糖、肽聚糖、磷壁酸等物质。替代激活途径在细菌性感染早期尚未产生特异性抗体时即可发挥重要的抗感染作用。吕邦泰等[17]、王红权等[18]研究分别发现，慢性乙肝、变应性鼻炎患者血清补体C3水平降低，说明补体C3在机体抗感染和免疫调节过程中发挥了重要作用。本研究也证实血清补体C3是OLP患者的血清差异蛋白，患者血清补体C3表达下调，说明OLP的发病过程可能与感染、免疫功能降低有关。

血浆脂蛋白中的蛋白部分主要分为A、B、C、D、E五类，载脂蛋白A又可分为Ⅰ～Ⅴ五类。李晓峰等[19]研究发现，恶性肿瘤患者血清载脂蛋白AⅠ表达紊乱。黄雪强等[20]研究发现，膀胱癌患者尿载脂蛋白AⅠ表达明显高于健康对照组。研究显示，慢性乙肝患者血清载脂蛋白AⅠ表达与正常人存在差异，部分正常人接种乙肝疫苗后口腔黏膜出现苔藓样改变[21，22]。本研究结果表明，OLP患者血清载脂蛋白AⅠ表达升高，推测其发病可能与乙肝病毒的感染及载脂蛋白AⅠ的异常表达有关。

人抗凝血酶Ⅲ是活性凝血因子中最重要的阻碍因子，参与血液凝固、纤维蛋白溶解过程，在弥散性血管内凝血、肝脏疾病、肾病综合征患者血清中表达均降低。本研究中，OLP患者血清人抗凝血酶Ⅲ表达降低，但变化幅度小于其他差异蛋白，未来需加大样本量进行验证，以明确人抗凝血酶Ⅲ是否可作为监测OLP病情的指标之一。

综上所述，OLP患者血清中存在12种差异蛋白质，血清补体C3、人抗凝血酶Ⅲ表达均降低，载脂蛋白AⅠ表达升高，其发病可能与免疫、感染有关。本研究将进一步探索OLP患者蛋白水平变化的作用机制，为该病的临床药物治疗提供依据。

[1] Anderson N. Proteome and proteom ics: new technologies,new concepts, and new words[J]. Electrophoresis, 1998,19(11):1853-1861.

[2] 夏其昌,曾嵘.蛋白质化学与蛋白质组学[M].北京：科学出版社,2004:233-234.

[3] Tang W. Quantitative analysis of plasma membrane proteome using two-dimensional difference gel electrophoresis[J]. Methods Mol Biol, 2012(876):67-82.

[4] Feret R, Lilley KS. Protein profiling using two-dimensional difference gel electrophoresis (2-D DIGE)[J]. Curr Protoc Protein Sci, 2014,75(22):1-17.

[5] Minden JS. Two-dimensional difference gel electrophoresis (2-D DIGE)[J]. Methods Mol Biol, 2012(869):287-304.

[6] Deng Z, Bu S, Wang ZY. Quantitative analysis of protein phosphorylation using two-dimensional difference gel electrophoresis (2-D DIGE)[J]. Methods Mol Biol, 2012(876):47-66.

[7] 王衍慧,傅明捷,黄玉宇,等.糖尿病肾病患者血浆动态蛋白质组学研究[J].山东医药,2014,54(9):17-19.

[8] Kruger NJ. The Bradford method for protein quantitation[J]. Methods Mol Biol, 1994(32):9-15.

[9] Zhou X, Xue L, Hao L, et al. Proteomics-based identification of tumor relevant proteins in lung adenocarcinoma[J]. Biomed Pharmacother, 2013,67(7):621-627.

[10] Paul D, Kumar A, Gajbhiye A, et al. Mass spectrometry-based proteomics in molecular diagnostics: discovery of cancer biomarkers using tissue culture[J]. Biomed Res Int, 2013,2013:783131.

[11] Bones J, Byrne JC, Donoghue N, et al. Glyconmic and glycoproteomic analysis of serum frompatients with stomach cancer reveals potential markers arising from host defense responsemechanisms[J]. J Proteome Res, 2011,10(3):1246-1265.

[12] 王宁,陈洋,姜奕.运用2D-DIGE 技术的结直肠癌差异蛋白质组学研究[J].中国普通外科杂志,2012,21(10):1212-1216.

[13] 张英剑,王萍,王伟.肝癌、肝硬化患者前期处理后腹水中差异蛋白质组学分析及意义[J].山东医药,2013,53(39):22-24.

[14] 许彦枝,杨凤英.口腔黏膜扁平苔藓差异基因筛选及其通路分析[J].中华临床医师杂志,2010,4(1):55-62.

[15] 王文梅,蒋文晖,胡勤刚.应用双向电泳和质谱技术筛选口腔扁平苔藓差异蛋白[J].实用口腔医学杂志,2008,24(1):120-123.

[16] 蒋红柳,王文梅,段宁.应用双向电泳-质谱技术筛选羟氯喹治疗口腔扁平苔藓前后的血清差异蛋白[J].上海口腔医学,2013,22(2):184-187.

[17] 吕邦泰,高国生,冯家飞.慢性乙型肝炎患者血清补体C3和C4检测的临床意义再探讨[J].中国卫生检验杂志,2012,22(6):1327-1328.

[18] 王红权,茅晓时,俞春海.变应性鼻炎患者血清补体C3测定[J].中国眼耳鼻喉科杂志,2012,12(4):229-231.

[19] 李晓峰,林禾禧,黄伟贤,等.恶性肿瘤患者血清载脂蛋白A1、B100水平与中医虚实辨证关系初探[J].中国中医基础医学杂志,2001,7(8):569-570.

[20] 黄雪强,李宏杰,李常颖,等.尿液载脂蛋白-A1在膀胱癌诊断中的应用[J].临床泌尿外科杂志,2015,30(2):99-103.

[21] 朱淑云.乙型肝炎疫苗接种后的口腔苔藓样损害[J].国外医学：口腔医学分册,2001,28(4):259.

[22] 鲁娇英,高国生,朱成亮.慢性乙型肝炎患者载脂蛋白A1、B、E的血清水平研究[J].医学研究杂志,2013,42(5):70-73.

Detections of differentially expressed serum proteins in patients with oral lichen planus and the significance

LIUJian,LIUTiejun,ANXin，LIKunshan,JIANan,XUYanzhi

(TheForthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Objective To detect the differentially expressed serum proteins in patients with oral lichen planus (OLP) and explore their significance. Methods Six OLP patients (observation group) and the matched health adults (control group) were selected and we drew their venous blood. Serum proteins were extracted by phenol extraction. The protein concentration was determined by Bradford method. Serum proteins were separated by two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE), the differential proteins were identified by mess spectrometry and the expression of the proteins was detected by Western blotting in the two groups. Results In average, the number of differential protein spots was (583±183), during which, 12 highly reproducible spots were selected for mass spectrometry identification. Of these 12 protein spots, the expression of seven proteins, including serum complement C3, kininogen, α-2-macroglobulin, human antithrombin Ⅲ, secretory IgA, complement C9and β-1-metal binding globulin (SHBG), was decreased in the observation group, the expression of five proteins including haptoglobin, ceruloplasmin, apolipoprotein A-Ⅰ, vitamin D and human factor B was increased in the observation group. Compared with the control group, the expression of serum complement C3and human antithrombin Ⅲ was lower, and the expression of apolipoprotein A-Ⅰwas higher in the observation group (allP<0.01). Conclusion There are 12 differential proteins in serum of OLP patients and the expression of serum complement C3and human antithrombin Ⅲ is lower which shows that the development of OLP may be associated with immune and infection.

oral lichen planus; two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis; proteomics; serum complement C3; apolipoprotein AⅠ; human antithrombin Ⅲ

国家自然科学基金资助项目(81273813)。

刘健(1975-)，女，副教授，研究方向为口腔黏膜病及牙周病的中西医结合治疗。E-mail： zjh888fff@163.com

许彦枝(1954-)，女，教授，研究方向为口腔黏膜病及牙周病的中西医结合治疗。E-mail： xu_yanzhi@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.004

R781.5

A

1002-266X(2016)16-0011-04

2015-11-10)