金铁锁对膝关节骨性关节炎兔关节软骨的保护作用及其机制

王胜民，刘毅，刘晓丽，熊华章，李豫皖，余峰

(1 遵义医学院附属医院，贵州遵义563000；2 遵义市第一人民医院;3 仁怀市人民医院)

·基础研究·

金铁锁对膝关节骨性关节炎兔关节软骨的保护作用及其机制

王胜民1，刘毅1，刘晓丽2，熊华章1，李豫皖1，余峰3

(1 遵义医学院附属医院，贵州遵义563000；2 遵义市第一人民医院;3 仁怀市人民医院)

目的 观察金铁锁对膝关节骨性关节炎(OA)兔关节软骨的保护作用，并探讨其作用机制。方法 将50只家兔随机分为空白对照组，金铁锁大、中、小剂量组和模型对照组，各10只。除空白对照组外，其余各组均按照改良Hulth法制备右膝关节OA模型。金铁锁大、中、小剂量组术后分别按体质量称取金铁锁粉末12.80、4.23、2.58 mg/kg，配制药物溶液10 mL灌胃，空白对照组及模型对照组灌服等量生理盐水，1次/d，连用8周。造模第8周处死家兔，取右膝股骨内侧髁组织，采用Mankin评分标准评价关节软骨退变情况，qRT-PCR法检测关节软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量。结果 空白对照组，金铁锁大、中、小剂量组和模型对照组Mankin评分分别为(0.80±0.20)、(2.60±0.16)、(3.40±0.16)、(5.10±0.38)、(10.40±0.16)分，各组Mankin评分依次升高，组间两两比较均有统计学差异(P均<0.01)。模型对照组软骨组织IL-6、TNF-α mRNA相对表达量均高于其余各组，空白对照组均低于其余各组，金铁锁大、中剂量组均低于金铁锁小剂量组(P均<0.05)。模型对照组软骨组织IL-1β mRNA相对表达量均高于其余各组，空白对照组、金铁锁大剂量组均低于金铁锁中、小剂量组(P均<0.05)。结论 金铁锁对膝关节OA兔的软骨具有保护作用，且呈浓度依赖性，机制可能与降低软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α表达有关。

骨性关节炎；膝关节；金铁锁；关节软骨；兔

金铁锁具有消痈排脓、止血、散瘀定痛等功效，主要用于治疗跌打损伤、创伤出血等[1, 2]。目前对金铁锁的研究大多为其化学成分、药理作用等方面，关于其对骨性关节炎(OA)的治疗作用少见报道。2015年1～8月，我们观察了金铁锁对膝关节OA兔关节软骨的保护作用，并探讨其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级健康成年家兔50只，体质量2.0～2.5 kg，雌雄不限，由遵义医学院动物实验基地养殖场提供。10%中性缓冲甲醛固定液(即用型)购于广州维格斯生物科技有限公司，动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(离心柱型)购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司，逆转录试剂盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)购于日本TaKaRa公司，实时荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)购于日本TaKaRa公司；金铁锁粉末购于贵州益佰制药股份有限公司。E200型显微镜购于日本Nikon公司。

1.2 造模与分组处理 将50只家兔随机分为空白对照组，金铁锁大、中、小剂量组和模型对照组，各10只。采用改良Hulth法[3, 4]制备兔右膝关节OA模型：耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg，术区备皮，常规消毒。行右膝正中切口，逐层切开，暴露右膝关节腔；切除前交叉韧带及内侧半月板，行抽屉试验确认前交叉韧带已完全断裂，缝合关节腔及皮肤。空白对照组仅切开右膝关节，不切除前交叉韧带以及内侧半月板。各组术后肌注青霉素钠20万U/kg，连用7 d。分笼饲养并每日驱赶。按照《药理实验方法学》中的方法计算给药剂量[5]，金铁锁大、中、小剂量组分别按体质量称取金铁锁粉末12.80、4.23、2.58 mg/kg，配制药物溶液10 mL，于造模当日灌胃给药；空白对照组及模型对照组灌服等量的生理盐水；1次/d，连用8周。

1.3 右膝关节大体观察及标本制作 各组造模第8周，采用空气栓塞法[6]处死所有家兔，取其右膝股骨内侧髁，生理盐水冲洗干净，肉眼观察关节软骨的完整性及色泽。将标本分为两份，分别采用10%甲醛及液氮(-196 ℃)进行固定。

1.4 关节软骨退变情况观察 HE染色[7]：取1.3中甲醛固定的右膝股骨内侧髁标本，脱钙后常规脱水，取关节软骨石蜡包埋，5 μm厚度切片。二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化后行Harris苏木精染色，水洗及盐酸乙醇分化，水洗蓝化，伊红染色。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察关节软骨结构及软骨细胞数量。番红染色[8]：取1.3中甲醛固定的右膝股骨内侧髁标本，脱钙后石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化后行番红染色。水洗及梯度乙醇水化，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察关节软骨基质染色及潮线变化。各组染色后采用Mankin评分标准评价关节软骨退变情况，评分越高说明关节软骨退变越严重。

1.5 关节软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量检测 采用qRT-PCR法。取1.3中液氮固定的右膝股骨内侧髁标本，在液氮环境下用无菌刀片剥离关节软骨50 mg；放于RNase free的离心管中，超声破碎仪充分破碎，裂解、离心后取水相层。参照试剂盒说明书提取标本总RNA，紫外分光光度计检测其浓度和纯度；以总RNA为模板，于冰上配制逆转录反应液，将mRNA逆转录为cDNA。以β-actin为内参进行qRT-PCR反应，严格按照SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒说明书进行操作。引物序列见表1。反应体系20.0 μL：ddH2O 6.4 μL，SYBR 10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上、下游引物各0.8 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s；60 ℃退火30 s，共40个循环。以2-ΔΔCt法计算TNF-α、 IL-1β、IL-6 mRNA的相对表达量[9，10]。

表1 IL-1β、IL-6、TNF-α及β-actin引物序列

2 结果

2.1 右膝关节情况 空白对照组右膝股骨内侧髁关节软骨透明，表面光滑、平整，无骨赘形成。金铁锁大剂量组右膝关节表面失去光泽，股骨内侧髁两侧无骨赘形成。金铁锁中剂量组右膝关节稍肿胀，色泽稍灰暗，表面欠光滑。金铁锁小剂量组右膝关节肿大，色泽灰暗，表面粗糙，股骨内侧髁两侧骨赘形成。模型对照组右膝关节肿胀明显，表面粗糙明显，关节面不平，部分软骨剥脱并显露软骨下骨，股骨内侧髁两侧骨赘形成。

2.2 关节软骨退变情况 空白对照组HE染色示软骨结构光整，细胞数量正常；番红染色示基质染色正常，潮线完整。金铁锁大剂量组HE染色示软骨表面局部见不规则裂隙，软骨细胞数量正常；番红染色示基质局部轻度减退，潮线完整。中剂量组HE染色示软骨表面局部见裂隙，软骨细胞数量正常；番红染色示基质轻度减退，潮线完整。金铁锁小剂量组HE染色示软骨表面有不规则裂隙，软骨细胞数量减少；番红染色示基质轻度或中度减退，潮线完整。模型对照组HE染色示软骨表面有不规则裂隙，软骨细胞数量明显减少；番红染色示基质中度或重度减退，多重潮线。见插页Ⅲ图5、6。空白对照组，金铁锁大、中、小剂量组和模型对照组Mankin评分分别为(0.80±0.20)、(2.60±0.16)、(3.40±0.16)、(5.10±0.38)、(10.40±0.16)分，多组间比较有统计学差异(P<0.01)；各组Mankin评分依次升高，组间两两比较均有统计学差异(P均<0.01)。

2.3 各组关节软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量比较 模型对照组软骨组织IL-6、TNF-α mRNA相对表达量均高于其余各组，空白对照组均低于其余各组，金铁锁大、中剂量组均低于金铁锁小剂量组(P均<0.05)。模型对照组软骨组织IL-1β mRNA相对表达量均高于其余各组，空白对照组、金铁锁大剂量组均低于金铁锁中、小剂量组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组关节软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量比较

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与金铁锁大剂量组比较，bP<0.05；与金铁锁中剂量组比较，cP<0.05；与金铁锁小剂量组比较，dP<0.05。

3 讨论

OA是一种以关节软骨变形和丢失，关节边缘和软骨下骨骨质再生为特征的慢性关节疾病[11]。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质构成，软骨基质主要由胶原纤维、蛋白多糖和水组成，上述成分结合使关节软骨具有承受负荷、抵抗应力及减少摩擦等作用，OA的始发部位就在关节软骨。为创建合理的关节软骨缺损动物模型，本研究采用了改良Hulth法。结果显示，造模第8周空白对照组关节软骨光滑，无骨赘形成，基质染色正常，潮线完整；模型对照组关节软骨见不规则裂隙，细胞数目减少，潮线不完整，基质染色失染；提示造模成功。本研究中，空白对照组、金铁锁大剂量组、金铁锁中剂量组、金铁锁小剂量组和模型对照组Mankin评分依次升高，且组间两两比较均有统计学差异；不仅说明本研究造模成功，亦表明金铁锁对膝关节OA兔具有软骨保护作用，且呈浓度依赖性。

IL-1β是OA发病过程中的一种重要炎症因子，可通过一系列级联反应引起关节的破坏和炎症反应[12]。IL-1β对膝关节OA的影响很复杂，主要是从改变软骨细胞正常结构与功能，促进软骨细胞凋亡发生，降解软骨细胞基质等多方面发挥作用，其软骨组织的中上层软骨细胞及其基质皆呈IL-1强阳性反应[13]。TNF-α参与介导多种炎症过程，OA的发病与关节滑膜细胞增殖旺盛并分泌过多的TNF-α有关[14]。TNF-α可以激活并聚集白细胞，增强白细胞吞噬功能，从而参与感染和自身免疫性疾病的调节[15]。

IL-6可能是TNF-α和IL-1β作用于其他细胞的中介物质，三者协同作用可加速OA的进展[16，17]。IL-6可刺激正常软骨、滑膜细胞产生前列腺素和胶原酶，增加关节炎性反应和由IL-1介导的基质金属蛋白酶的分泌。研究表明，IL-6能够促进OA患者关节软骨细胞生成IL-1受体拮抗剂、可溶性TNF受体等，从而减轻关节组织的炎症反应[18]。本研究中，模型对照组软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量均明显高于其余各组，而金铁锁大、中剂量组软骨组织IL-6、TNF-α mRNA相对表达量均明显低于金铁锁小剂量组，金铁锁大剂量组软骨组织IL-1β mRNA相对表达量均明显低于金铁锁中、小剂量组，说明金铁锁对膝关节OA兔关节软骨的保护作用可能与其降低上述炎性因子表达有关，并呈浓度依赖性。

综上所述，金铁锁对膝关节OA兔的关节软骨具有保护作用，且呈浓度依赖性，机制可能与降低软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α表达有关。但是关于金铁锁对膝关节OA软骨保护的其他作用机制仍需进一步研究。

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贵州省科技厅社发攻关基金资助项目(黔科合SY[2010]3091号)；遵义医学院附属医院硕士启动基金项目(院字[2013]20号)。

刘毅(E-mail： 13308529536@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.008

R684.3

A

1002-266X(2016)16-0027-03

2015-11-10)