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金铁锁对膝关节骨性关节炎兔关节软骨的保护作用及其机制

2016-05-10王胜民刘毅刘晓丽熊华章李豫皖余峰

山东医药 2016年16期
关键词:铁锁小剂量空白对照

王胜民,刘毅,刘晓丽,熊华章,李豫皖,余峰

(1 遵义医学院附属医院,贵州遵义563000;2 遵义市第一人民医院;3 仁怀市人民医院)

·基础研究·

金铁锁对膝关节骨性关节炎兔关节软骨的保护作用及其机制

王胜民1,刘毅1,刘晓丽2,熊华章1,李豫皖1,余峰3

(1 遵义医学院附属医院,贵州遵义563000;2 遵义市第一人民医院;3 仁怀市人民医院)

目的 观察金铁锁对膝关节骨性关节炎(OA)兔关节软骨的保护作用,并探讨其作用机制。方法 将50只家兔随机分为空白对照组,金铁锁大、中、小剂量组和模型对照组,各10只。除空白对照组外,其余各组均按照改良Hulth法制备右膝关节OA模型。金铁锁大、中、小剂量组术后分别按体质量称取金铁锁粉末12.80、4.23、2.58 mg/kg,配制药物溶液10 mL灌胃,空白对照组及模型对照组灌服等量生理盐水,1次/d,连用8周。造模第8周处死家兔,取右膝股骨内侧髁组织,采用Mankin评分标准评价关节软骨退变情况,qRT-PCR法检测关节软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量。结果 空白对照组,金铁锁大、中、小剂量组和模型对照组Mankin评分分别为(0.80±0.20)、(2.60±0.16)、(3.40±0.16)、(5.10±0.38)、(10.40±0.16)分,各组Mankin评分依次升高,组间两两比较均有统计学差异(P均<0.01)。模型对照组软骨组织IL-6、TNF-α mRNA相对表达量均高于其余各组,空白对照组均低于其余各组,金铁锁大、中剂量组均低于金铁锁小剂量组(P均<0.05)。模型对照组软骨组织IL-1β mRNA相对表达量均高于其余各组,空白对照组、金铁锁大剂量组均低于金铁锁中、小剂量组(P均<0.05)。结论 金铁锁对膝关节OA兔的软骨具有保护作用,且呈浓度依赖性,机制可能与降低软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α表达有关。

骨性关节炎;膝关节;金铁锁;关节软骨;兔

金铁锁具有消痈排脓、止血、散瘀定痛等功效,主要用于治疗跌打损伤、创伤出血等[1, 2]。目前对金铁锁的研究大多为其化学成分、药理作用等方面,关于其对骨性关节炎(OA)的治疗作用少见报道。2015年1~8月,我们观察了金铁锁对膝关节OA兔关节软骨的保护作用,并探讨其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级健康成年家兔50只,体质量2.0~2.5 kg,雌雄不限,由遵义医学院动物实验基地养殖场提供。10%中性缓冲甲醛固定液(即用型)购于广州维格斯生物科技有限公司,动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(离心柱型)购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司,逆转录试剂盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)购于日本TaKaRa公司,实时荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)购于日本TaKaRa公司;金铁锁粉末购于贵州益佰制药股份有限公司。E200型显微镜购于日本Nikon公司。

1.2 造模与分组处理 将50只家兔随机分为空白对照组,金铁锁大、中、小剂量组和模型对照组,各10只。采用改良Hulth法[3, 4]制备兔右膝关节OA模型:耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg,术区备皮,常规消毒。行右膝正中切口,逐层切开,暴露右膝关节腔;切除前交叉韧带及内侧半月板,行抽屉试验确认前交叉韧带已完全断裂,缝合关节腔及皮肤。空白对照组仅切开右膝关节,不切除前交叉韧带以及内侧半月板。各组术后肌注青霉素钠20万U/kg,连用7 d。分笼饲养并每日驱赶。按照《药理实验方法学》中的方法计算给药剂量[5],金铁锁大、中、小剂量组分别按体质量称取金铁锁粉末12.80、4.23、2.58 mg/kg,配制药物溶液10 mL,于造模当日灌胃给药;空白对照组及模型对照组灌服等量的生理盐水;1次/d,连用8周。

1.3 右膝关节大体观察及标本制作 各组造模第8周,采用空气栓塞法[6]处死所有家兔,取其右膝股骨内侧髁,生理盐水冲洗干净,肉眼观察关节软骨的完整性及色泽。将标本分为两份,分别采用10%甲醛及液氮(-196 ℃)进行固定。

1.4 关节软骨退变情况观察 HE染色[7]:取1.3中甲醛固定的右膝股骨内侧髁标本,脱钙后常规脱水,取关节软骨石蜡包埋,5 μm厚度切片。二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化后行Harris苏木精染色,水洗及盐酸乙醇分化,水洗蓝化,伊红染色。梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察关节软骨结构及软骨细胞数量。番红染色[8]:取1.3中甲醛固定的右膝股骨内侧髁标本,脱钙后石蜡包埋切片,二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化后行番红染色。水洗及梯度乙醇水化,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察关节软骨基质染色及潮线变化。各组染色后采用Mankin评分标准评价关节软骨退变情况,评分越高说明关节软骨退变越严重。

1.5 关节软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量检测 采用qRT-PCR法。取1.3中液氮固定的右膝股骨内侧髁标本,在液氮环境下用无菌刀片剥离关节软骨50 mg;放于RNase free的离心管中,超声破碎仪充分破碎,裂解、离心后取水相层。参照试剂盒说明书提取标本总RNA,紫外分光光度计检测其浓度和纯度;以总RNA为模板,于冰上配制逆转录反应液,将mRNA逆转录为cDNA。以β-actin为内参进行qRT-PCR反应,严格按照SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒说明书进行操作。引物序列见表1。反应体系20.0 μL:ddH2O 6.4 μL,SYBR 10.0 μL,cDNA 2.0 μL,上、下游引物各0.8 μL。反应条件:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性10 s;60 ℃退火30 s,共40个循环。以2-ΔΔCt法计算TNF-α、 IL-1β、IL-6 mRNA的相对表达量[9,10]。

表1 IL-1β、IL-6、TNF-α及β-actin引物序列

2 结果

2.1 右膝关节情况 空白对照组右膝股骨内侧髁关节软骨透明,表面光滑、平整,无骨赘形成。金铁锁大剂量组右膝关节表面失去光泽,股骨内侧髁两侧无骨赘形成。金铁锁中剂量组右膝关节稍肿胀,色泽稍灰暗,表面欠光滑。金铁锁小剂量组右膝关节肿大,色泽灰暗,表面粗糙,股骨内侧髁两侧骨赘形成。模型对照组右膝关节肿胀明显,表面粗糙明显,关节面不平,部分软骨剥脱并显露软骨下骨,股骨内侧髁两侧骨赘形成。

2.2 关节软骨退变情况 空白对照组HE染色示软骨结构光整,细胞数量正常;番红染色示基质染色正常,潮线完整。金铁锁大剂量组HE染色示软骨表面局部见不规则裂隙,软骨细胞数量正常;番红染色示基质局部轻度减退,潮线完整。中剂量组HE染色示软骨表面局部见裂隙,软骨细胞数量正常;番红染色示基质轻度减退,潮线完整。金铁锁小剂量组HE染色示软骨表面有不规则裂隙,软骨细胞数量减少;番红染色示基质轻度或中度减退,潮线完整。模型对照组HE染色示软骨表面有不规则裂隙,软骨细胞数量明显减少;番红染色示基质中度或重度减退,多重潮线。见插页Ⅲ图5、6。空白对照组,金铁锁大、中、小剂量组和模型对照组Mankin评分分别为(0.80±0.20)、(2.60±0.16)、(3.40±0.16)、(5.10±0.38)、(10.40±0.16)分,多组间比较有统计学差异(P<0.01);各组Mankin评分依次升高,组间两两比较均有统计学差异(P均<0.01)。

2.3 各组关节软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量比较 模型对照组软骨组织IL-6、TNF-α mRNA相对表达量均高于其余各组,空白对照组均低于其余各组,金铁锁大、中剂量组均低于金铁锁小剂量组(P均<0.05)。模型对照组软骨组织IL-1β mRNA相对表达量均高于其余各组,空白对照组、金铁锁大剂量组均低于金铁锁中、小剂量组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组关节软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量比较

注:与空白对照组比较,aP<0.05;与金铁锁大剂量组比较,bP<0.05;与金铁锁中剂量组比较,cP<0.05;与金铁锁小剂量组比较,dP<0.05。

3 讨论

OA是一种以关节软骨变形和丢失,关节边缘和软骨下骨骨质再生为特征的慢性关节疾病[11]。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质构成,软骨基质主要由胶原纤维、蛋白多糖和水组成,上述成分结合使关节软骨具有承受负荷、抵抗应力及减少摩擦等作用,OA的始发部位就在关节软骨。为创建合理的关节软骨缺损动物模型,本研究采用了改良Hulth法。结果显示,造模第8周空白对照组关节软骨光滑,无骨赘形成,基质染色正常,潮线完整;模型对照组关节软骨见不规则裂隙,细胞数目减少,潮线不完整,基质染色失染;提示造模成功。本研究中,空白对照组、金铁锁大剂量组、金铁锁中剂量组、金铁锁小剂量组和模型对照组Mankin评分依次升高,且组间两两比较均有统计学差异;不仅说明本研究造模成功,亦表明金铁锁对膝关节OA兔具有软骨保护作用,且呈浓度依赖性。

IL-1β是OA发病过程中的一种重要炎症因子,可通过一系列级联反应引起关节的破坏和炎症反应[12]。IL-1β对膝关节OA的影响很复杂,主要是从改变软骨细胞正常结构与功能,促进软骨细胞凋亡发生,降解软骨细胞基质等多方面发挥作用,其软骨组织的中上层软骨细胞及其基质皆呈IL-1强阳性反应[13]。TNF-α参与介导多种炎症过程,OA的发病与关节滑膜细胞增殖旺盛并分泌过多的TNF-α有关[14]。TNF-α可以激活并聚集白细胞,增强白细胞吞噬功能,从而参与感染和自身免疫性疾病的调节[15]。

IL-6可能是TNF-α和IL-1β作用于其他细胞的中介物质,三者协同作用可加速OA的进展[16,17]。IL-6可刺激正常软骨、滑膜细胞产生前列腺素和胶原酶,增加关节炎性反应和由IL-1介导的基质金属蛋白酶的分泌。研究表明,IL-6能够促进OA患者关节软骨细胞生成IL-1受体拮抗剂、可溶性TNF受体等,从而减轻关节组织的炎症反应[18]。本研究中,模型对照组软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量均明显高于其余各组,而金铁锁大、中剂量组软骨组织IL-6、TNF-α mRNA相对表达量均明显低于金铁锁小剂量组,金铁锁大剂量组软骨组织IL-1β mRNA相对表达量均明显低于金铁锁中、小剂量组,说明金铁锁对膝关节OA兔关节软骨的保护作用可能与其降低上述炎性因子表达有关,并呈浓度依赖性。

综上所述,金铁锁对膝关节OA兔的关节软骨具有保护作用,且呈浓度依赖性,机制可能与降低软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α表达有关。但是关于金铁锁对膝关节OA软骨保护的其他作用机制仍需进一步研究。

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贵州省科技厅社发攻关基金资助项目(黔科合SY[2010]3091号);遵义医学院附属医院硕士启动基金项目(院字[2013]20号)。

刘毅(E-mail: 13308529536@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.008

R684.3

A

1002-266X(2016)16-0027-03

2015-11-10)

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