中华芦荟内生真菌抑菌活性研究

2016-05-09李玲玲罗合春张先淑

生物学杂志 2016年2期

关键词：内生真菌抑菌活性

李玲玲, 罗合春, 张先淑

(重庆工贸职业技术学院生物化学工程系，重庆 408000)

中华芦荟内生真菌抑菌活性研究

李玲玲, 罗合春, 张先淑

(重庆工贸职业技术学院生物化学工程系，重庆 408000)

摘要从中华芦荟的根和叶中分离出8株内生真菌，其中5株来自叶部，3株来自根部，将分离到的内生真菌对4种指示菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、大肠埃希菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae进行抑菌试验，发现叶部和根部各有一株内生真菌对3种指示细菌表现出抑菌活性，且叶部的内生真菌对啤酒酵母也有抑制效果。经形态学鉴定，这两株内生真菌都属于黑曲霉。

关键词内生真菌; 中华芦荟; 抑菌活性

Study on antimicrobial activity of endophytic fungi from Aloeveral.var.chinesis(haw.)

LI Ling-ling, LUO He-chun, ZHANG Xian-shu

(Biochemistry Engineering Department, Chongqing Industry & Trade Polytechnic, Chongqing 408000, China)

Abstract Eight strains of endophytic fungi were isolated from the leaf and root ofAloeveral.var.chinesis(haw.), in which, five from the leaf and three from the root. The antimicrobial activity from endophytic fungi was investigated by using the agar diffusion method and the cylinder plate method withBacillussubtilis,Escherichiacoli,StaphylococcusaureusandSaccharomycescerevisiaeas indicator microorganisms. The results showed that two of endophytic fungi which one was isolated from the leaf and the other from root had inhibitory activities toBacillussubtilis,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus, and the endophytic fungi from leaf showed antimicrobial activity toSaccharomycescerevisiae. They were classified asAspergillusNigerby their morphological features.

Keywords endophytic fungi;aloeveral.var.chinesis(haw.); antimicrobial activity

芦荟是百合科(Liliaceae)芦荟属(Aloe) 多年生肉质草本植物，作为生药在我国已有1 000多年的应用历史。其体内有160多种化学成分，其中药用成分72种(多糖、蒽醌类、葡萄糖苷、脂类、有机酸、尿苷酸、多种酶、氨基酸、抗生素、皂角素、维生素等主要成分)，具有免疫调节与抗肿瘤，抗菌、消炎、抗病毒、抗辐射，促进伤口愈合及护肤，对心血管病有一定的疗效等。芦荟药用成分中的大黄素和多糖、糖蛋白均具有抗病毒、抗菌活性等[1]。在芦荟内生菌研究方面，国内李能章和彭远义从中华芦荟组织中分离出一株能产生广谱抗菌活性物质的内生细菌[2]。尹建雯等对从中华芦荟[Aloeveral. var.Chinese(Haw Berg)]、元江芦荟(A．yuanjiangensisXiong & Zheng sp．nov．)及库拉索芦荟(A．barbadsisMill．)的根、叶、花柄、花中，分离到88株内生真菌，作了革兰氏阳性和阴性细菌的抑菌试验，研究了其抗菌活性[3, 4]。同时也对88株内生真菌进行了抗真菌活性物质筛选，其中35株芦荟内生真菌对多种皮肤致病真菌具有抑制生长作用[5]。黄江华等进行了库拉索芦荟内生真菌类群与分布的初步研究[6]。王莉衡等研究了芦荟内生菌内生哈次木霉LH-7对植物病原菌的抗性[7]。柯野等从中华芦荟的根和叶中分离出内生真菌40株，分别对其液体发酵液进行抗菌活性检测，发现青霉属LH4和头孢属LH34菌株具有抗菌活性[8]。内生真菌能产生与宿主相同或相似的生物活性成分，因此由芦荟内生真菌生产与芦荟相同或相近的药用成分，是一条生产药用代谢产物有效的、快速的途径。本研究以中华芦荟的根和叶为材料，分离内生真菌，并对其抗菌活性研究，旨在寻找活性较好的内生真菌，为寻找新型抗菌物质提供资源，同时也为后期的代谢产物研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

药用植物标本：一株生长良好的无病变、无虫咬的芦荟，2014年10月份采集于重庆市涪陵区，全株取样后放入塑料袋中，带回实验室冲洗干净，备用。

供试指示菌：大肠埃希菌Escherichiacoli购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus和啤酒酵母Saccharomycescerevisiae为重庆工贸职业技术学院微生物实验室保存。

培养基：PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)用于分离内生真菌，液体培养基用于内生真菌的液体培养；牛肉膏蛋白胨培养基用于指示细菌的培养。

培养啤酒酵母指示菌的培养基配方Ⅳ[9]：胨30 g，柠檬酸钠30 g，葡萄糖30 g，NaCl 30 g，琼脂15～20 g，水1 000 mL，初始pH 6.2～6.6。

1.2方法

1.2.1 材料的表面消毒

按常规无菌操作，取中华芦荟的根和叶，按下列程序进行表面消毒：流水冲洗5 h→75%酒精漂洗2 min→无菌水冲洗3次→5.4% NaClO溶液浸泡(叶5 min，根10 min)→无菌水冲洗3次，最后一次冲洗液留下备用。

1.2.2 内生真菌的分离和纯化

用无菌滤纸将各材料水分吸干后，分别称取2 g，加10 mL无菌水研磨，取上清液0.1 mL涂布在PDA平板上，倒放于28℃培养7 d。

平板上菌落长出后，根据菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等特征判断分离出的菌落种类并计数，用平板划线及直接用接种针取尖端菌丝等分离纯化方法，经过反复分离、纯化，直至得到纯化的典型菌落。

将已纯化的菌株分别转接到斜面培养基上培养，待菌株生长旺盛时。取出置4℃保藏。

1.2.3 消毒可靠性检验

1)漂洗液培养检查。把最后一次漂洗消毒材料的漂洗液吸取0.1 mL涂布于PDA平板上，与内生真菌分离平板放于相同条件下培养(倒放于28℃培养7 d)，观察培养结果。

2)组织印迹检查。用灭菌镊子夹住已消毒过的芦荟的根和叶，使其表面分别与PDA平板接触5 min后取出，倒放于与内生真菌分离平板相同条件下培养(28℃培养7 d)，观察培养基上是否有菌落生长。

1.2.4抑菌试验

1)抗菌活性内生真菌的初筛

待检内生真菌培养：挑取经活化的内生真菌菌丝或孢子点接至PDA固体平板中央，28℃恒温培养7 d，备用。

指示菌培养：将指示菌接种于相应斜面上进行培养，其中细菌指示菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃培养18 h；啤酒酵母接种于Ⅳ号培养基斜面上，30℃培养48h。待指示菌长出后，10 mL无菌冷却生理盐水将菌苔洗下，打散，制备成菌悬液。

抑菌试验：参照文献[10]的琼脂块法进行抗菌活性的初筛。

2)内生真菌代谢产物抑菌活性测定

待检内生真菌液体培养：在250 mL三角瓶中装入100 mL培养基，灭菌冷却后，将各待检菌接入相应的液体培养基中，28℃、130 r/min条件下摇瓶培养5 d。无菌条件下取发酵液4 mL于离心管中，8 000 r/min离心5 min，收集上清作抑菌试验。

指示菌培养：同1.2.4。

抑菌实验：参考文献[11]的双层平板法进行内生真菌代谢产物抑菌活性测定，分别将待检发酵上清液100 μL加入牛津杯，每种待检上清液3个重复。放入4℃冰箱预培养7 h后，细菌指示菌平板放至30℃培养18 h，啤酒酵母指示菌平板放至30℃培养36 h，观察并测量抑菌圈直径。

1.2.5具抑菌活性内生真菌形态学鉴定

对具有抑菌活性的内生真菌采用点植培养法和小室培养法进行形态学鉴定。

2 结果与分析

2.1消毒可靠性检验结果

两种检验方法所用平板在PDA平板上培养一周后，取出观察，均无菌落生长，证明中华芦荟的根和叶表面消毒是彻底的，分离平板上长出的是内生真菌。

2.2中华芦荟内生真菌的组成

根据内生真菌菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等特征判断，从中华芦荟中共分离到8株内生真菌，叶部5株，根部3株。

表1 中华芦荟内生真菌抑菌活性初筛结果

“+”：抑菌圈直径d≤1cm；“++”：1 cm﹤d﹤1.5 cm；“+++”：d>1.5 cm；“-”：无抑菌性。

2.3抗菌活性内生真菌初筛

中华芦荟内生真菌抗菌活性初筛结果见表1，从表1可以看出，8株内生真菌中有2株表现出了抑菌活性，一株来自于叶部，对4种指示菌均有抑菌活性；一株来自于根部，对3种指示细菌均有抑菌活性。

2.4内生真菌代谢产物抑菌活性测定结果

采用双层平板法对8种内生真菌发酵代谢产物进行抑菌活性筛选，结果表明，叶部(LHY-02)和根部(LHG-01)均有一株内生真菌发酵上清液对3种指示细菌表现出一定的抑菌活性，见表2和图1。叶部内生真菌LHY-02对指示细菌的抑菌圈大，且LHY-02同时对酵母也表现出了一定的抑制活性，因此LHY-02对指示菌的抑菌活性要强一些。

表2 中华芦荟内生真菌发酵上清液的抑菌活性

A：枯草芽孢杆菌；B：大肠杆菌；C：金黄色葡萄球菌。

图1 中华芦荟内生真菌的抑菌作用

Fig 1 Antimicrobial activity of endophytic fungi

fromAloeveral.var.chinesis(haw.)

2.5具抑菌活性内生真菌形态学鉴定结果

经菌落形态观察，抑菌活性好的内生真菌LHY-02和LHG-01的菌落蔓延，初期菌丝黄色，后期变成黑色厚绒状，背面浅黄色，分生孢子头褐黑色。小室镜检，顶囊大球形，分生孢子球形，呈黑色。形态学初步鉴定这两株内生真菌均属于黑曲霉属。

3讨论

影响内生真菌分离的因素比较多，首先与采用的消毒条件有关，消毒过轻，可能会使材料表面的杂菌混入，消毒过重，会使部分内生菌被杀死；其次，与分离所采用的培养基有关，即使使用不同种类的培养基也不能确保将植物中的所有内生菌全部分离出来，有些内生菌不能在人工培养基上生长，有些内生菌生长缓慢被生长相对较快的菌株所覆盖，这样就造成了分离内生菌过程中某些菌株分离不到[12]；另外，还与植物本身的年龄有关，多年生植株，生长时间越长，分离到的内生菌就越多；最后植物采集时的产地、湿度、季节、所处的海拔高度等也会影响内生菌的分布和数量。本次分离到的具有抑菌活性的两株内生真菌分别来自于根部和叶部，且都属于黑曲霉，而在文献[5]和文献[8]的研究中，未有从中华芦荟中分离出黑曲霉，可见从一种植物中分离内生真菌时，所采用植株不同，分离到的内生真菌也不同。

通过对中华芦荟的根和叶部内生真菌的分离，共分离到8株内生真菌，其中5株来自叶部，3株来自根部，抑菌试验结果表明叶部和根部各有一株内生真菌对3种指示细菌表现出抑菌活性，且叶部的内生真菌对啤酒酵母也有抑制效果。这两株内生真菌的菌落特征相似，镜检时分生孢子头和分生孢子也很相似，都属于黑曲霉属，但叶部内生真菌对细菌的抑制效果较根部内生真菌稍强，抗菌谱较根部内生真菌广，而且叶部分离到的内生真菌也较多，这说明因芦荟抗菌活性成分主要存在于叶中，从而导致与其长期共存的内生真菌活性较其他部位强。这一结论为内生真菌分离时宿主植物部位的选择提供了依据，选择宿主植物活性成分集中部位去分离内生真菌，分离到有价值的内生真菌可能性更大。

参考文献:

[1]杨大庆. 芦荟的药用机理研究[J]. 陕西中医, 2004, 25(7):641-642.

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[3]尹建雯, 陈有为, 杨丽源, 等.芦荟植物内生真菌的研究Ⅰ.内生真菌的分离及鉴定[J].微生物学杂志, 2004, 24(1): 25-26.

[4]尹建雯, 陈有为, 李治滢, 等.芦荟植物内生真菌的研究Ⅱ.抗菌活性初探[J].微生物学杂志, 2004, 24(2): 30-33.

[5]尹建雯, 陈有为, 徐闻, 等.芦荟植物内生真菌抗真菌活性的研究[J].现代农业科技, 2005, 12: 18-19.

[6]黄江华, 向梅梅, 姜子德.库拉索芦荟内生真菌类群与分布的初步研究[J].安徽农业科学, 2008, 36(13) :5480 - 5481.

[7]王莉衡, 柯杨, 强毅, 等. 芦荟内生菌内生哈茨木霉LH-7对植物病原菌的抗性[J].应用生态学报, 2014, 25(4) : 1130 -1136.

[8]柯野, 方白玉, 曾松荣. 粤北地区中华芦荟内生真菌的初步研究[J].菌物研究, 2007, 5(3): 134-136.

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[11]王玉君, 崔晋龙, 苏红, 等.远志内生真菌抑菌活性筛选[J].微生物学通报, 2009, 36(3):404-411.