组织蛋白酶B在膀胱移形细胞癌中表达与复发的相关性*

唐硕 魏强 王安果 张宗平 文焰林 李云祥

组织蛋白酶B在膀胱移形细胞癌中表达与复发的相关性*

唐硕1魏强2王安果1张宗平1文焰林1李云祥1

(1.川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院泌尿外科, 四川 南充637000；

2.四川大学华西医院泌尿外科， 四川 成都 610041)

目的 探讨组织蛋白酶B(CB)在膀胱移行细胞癌(BTCC)组织中的表达及与肿瘤复发的关系。方法 收集1994～2011年复发的膀胱移形细胞癌标本，共计病理组织切片172份，用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法行CB免疫组织化学染色并计算CB阳性细胞百分率。 结果 癌组织中CB阳性细胞以弥散分布为主,细胞周围基质染色明显。BTCC组织中CB标记指数(21.53±4.27)较正常组织(0.34±0.18)明显升高(P<0.05)；高分级癌组织中CB标记指数(27.25±4.82)较低分级(14.38±5.83)明显增高(P<0.05)；复发组随复发次数进一步增高(P<0.05)；分期高的癌组织中CB值(24.68±5.42)较低期癌组织中(17.24±6.23)明显升高(P<0.05)。结论 组织蛋白酶B在正常膀胱粘膜中几乎不染色或仅见少许零星的阳性细胞，在分级和分期高的癌组织中染色明显，多为弥散阳性染色,CB可作为判断BTCC患者的进展和预后的一个重要指标。

组织蛋白酶B; 膀胱移形细胞癌; 复发; 免疫组化

肿瘤复发预示着肿瘤细胞的活动, 复发与转移是关注的焦点, 恶性肿瘤的复发显示了肿瘤细胞的动态活动，复发本身就是对患者的直接损害，不仅如此，肿瘤细胞的动态活动还预示着肿瘤的浸润与转移。组织蛋白酶B(CB)在多种恶性肿瘤中呈现高表达并与侵袭和转移相关。本研究通过免疫组织化学方法,检测CB在复发性膀胱癌中的表达,探讨其与膀胱移行细胞癌(BTCC)复发以及不同的病理分级，临床分期之间的关系，从而为膀胱移行细胞癌的早期诊断，肿瘤进展，肿瘤复发，恶性程度评估，以及预后提供重要的依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源 收集1994～2006年76例复发膀胱移形细胞癌标本病理组织172份。其中男57例，女19例，年龄28～81岁，平均58.9岁。其中，123例次行TUR-Bt术，18例次行膀胱部分切除术，31例次行根治性膀胱切除术。所有患者术前均未行全身药物化疗、放射治疗以及免疫生物治疗。172份病理标本按WHO新病理标准分级：低级别肿瘤92例，高级别肿瘤80例。另取16例正常膀胱粘膜作为正常对照。

1.2 检测方法 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP 法)，取各组组织石蜡切片，常规二甲苯脱蜡，乙醇水化。用蒸馏水新鲜配置3%H2O2-甲醇液去除内源性过氧化物酶，然后用正常兔血清封闭。用 1∶200兔抗人CB (武汉博士德生物工程有限公司)作为一抗，滴加后 4 ℃过夜；次日滴加羊抗兔 IgG 作为二抗，作用 60 min，与链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物培养 30 min。二氧基联苯胺显色，苏木精复染。二抗试剂盒由美国ZYMED公司生产。每次试验均设置阴性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗，结果显示阴性。在在高倍镜下每一组织切片中随机选择 10 个区域，共计数 2 000 个细胞，计算 CB 阳性细胞百分比。CB 阳性细胞为细胞质或细胞核呈棕色，颗粒状或弥散状染色，其余则为阴性细胞。

1.3 统计学处理 采用统计学SPSS11.5软件，数据采用均数±标准差表示，应用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

组织蛋白酶B 在癌组织中可为细胞核染色,还可同时伴有基质染色,基质染色可在组织蛋白酶B 阳性细胞周围,也可表现为肿瘤细胞单纯基质染色，并且在肿瘤细胞周边部染色更明显。在正常膀胱组织中基质无着色。组织蛋白酶B 阳性细胞分布于BTCC的自基层到表层的所有层中,其标记指数与切片肿瘤分级、分期密切相关，根据相关临床数据统计也与肿瘤复发密切相关。

将膀胱癌组织与正常组织进行组织蛋白酶B表达的比较发现正常组织中16例组织蛋白酶B阳性，组织蛋白酶B阳性细胞率(0.34±0.18)%，而在癌组织中却可见到明显的表达，172例阳性，组织蛋白酶B阳性细胞率(21.53±4.27)%，较正常组织明显升高(P<0.05)。

病理分级中，高分级癌组织中组织蛋白酶B标记指数较低分级明显增高，其差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。通过对复发组与原发组的比较，发现随着复发次数的增加其表达会进一步增强，其差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 BTCC组织中组织蛋白酶B与病理分级的关系

Table 1 The relationship of cathepsin B and pathological grading in BTCC tissues

BTCC病理n组织蛋白酶B阳性细胞低级9214.38±5.83高级8027.25±4.82①

注：①和低分级癌组织相比P<0.05

表2 BTCC组织中组织蛋白酶B表达与复发的相关性

Table 2 The expression correlated of cathepsin B with recurrence in BTCC tissues

样本n组织蛋白酶B阳性细胞正常对照组160.34±0.18原发组7617.48±7.20第一次复发组4120.52±5.28第二次复发组3222.98±5.39第三次或以上复发组2325.124±4.53

注：每组间比较P<0.05

3 讨论

Cathepsin B属于半胱氨酸蛋白酶类。组织蛋白酶B通常以酶原的形式存在，需要激活后才能降解蛋白，组织蛋白酶B具有双重蛋白水解活性使之能直接参与多种基底膜蛋白降解。生理情况下约10%酶原被分泌至胞浆，然后被其他蛋白水解酶水解或自身激活，参与许多生理过程，如激素原激活、抗原呈递、组织器官发育等[1]。但病理状态下，各种原因所致细胞损伤，如病原微生物、炎症因子及氧化应激等，导致溶酶体膜稳定性降低，通透性增高甚至破裂，大量组织蛋白酶B释放到胞浆或组织间隙，并被激活，介导细胞炎性坏死及凋亡的发生[2]，与关节炎、胰腺炎及其他急慢性炎症性疾病有关。组织蛋白酶B还参与肿瘤血管的形成，新生血管形成是肿瘤生长、转移发展所必需的，其形成不仅使肿瘤生长，而且由于新生血管基底膜的缺损从而提供了癌细胞进人血管的途径，促进肿瘤细胞的血行扩散[3]。Sinha等用原位杂交技术发现人前列腺癌组织中，CBmRNA呈不均匀染色，且在肿瘤浸润边缘染色最深，同时还发现前列腺癌内皮细胞中组织蛋白酶B表达增高，在正常及BPH中则不增加，这提示组织蛋白酶B可能参与前列腺癌组织中血管的生成[5，6]。以上这些现象和研究均说明CB可以促进肿瘤血管的形成，代表了肿瘤的转移或转移趋势。

Weiss等应用浸润性移行细胞癌细胞系EJ和非浸润性移行细胞癌细胞系RT4观察了组织蛋白酶B在人类膀胱肿瘤浸润中的作用[7]。浸润性EJ细胞具有位于胞浆膜活性的组织蛋白酶B而非浸润性RT4细胞则限于溶酶体中，主要是其前体形式。EJ 细胞胞质膜而不是RT4 细胞系的胞质膜具有降解纯化的层粘连蛋白的能力;认为浸润性肿瘤细胞在其胞质膜中具有增强的组织蛋白酶B,可降解基底膜成分而利于肿瘤的浸润和转移。 Eijan等发现膀胱癌患者尿液中组织蛋白酶B的活性较高，并与肿瘤分期、分级相关[9，10]。应用Wester blot分析膀胱移行细胞癌标本，结果表明浸润型较浅表型CB表达高[9]。在骨肉瘤中也有类似发现，在肉瘤侵袭边缘的组织蛋白酶B存在高表达现象，而在其相邻的正常组织中则无表达最近的研究表明，膀胱肿瘤病人癌组织的细胞组织蛋白酶B、组织蛋白酶B高于对照组及癌旁组织[10，11]。同时还表明癌组织细胞不仅表达更多的组织蛋白酶而且更易释放组织蛋白酶，在细胞膜降解、肿瘤侵袭方面扮演着积极的角色。

4 结论

组织蛋白酶B 阳性表达在分级和分期高的癌组织中较低级、低期癌组织中增强，且在肿瘤组织的周边部染色更明显，出现组织蛋白酶B阳性细胞聚集或基质染色，表明伴随恶性度的增高,组织蛋白酶B阳性表达增高,提示其与膀胱癌恶性度的相关性。通过对每次复发的比较，发现随着复发次数的增加组织蛋白酶B阳性标记指数在一定范围内增加，一旦出现分级突破其标记指数会显著增加，揭示了组织蛋白酶B在肿瘤复发与演进中的表达意义。

【参考文 献】

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Expression of cathepsin B in bladder transitional cell carcinoma tissues and its correlation with the recurrence of carcinoma

TANG Shuo1，WEI Qiang2,WANG Anguo1,etal

(1.DepartmentofUrology,TheSecondClinicalHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China;2.DepartmentofUrology，WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China)

Objective To evaluation the expression of cathepsin B in the transitional cell carcinorma of bladder (BTCC) and its correlation with the recurrence of carcinoma. Methods 172 tissues were collected from BTCC patients recurred for 3 times or more (3 times is contained) from 1994 to 2010. Immunohistochemical staining of CB in TCC and normal tissues was carried out by the streptavidin-biotin method. Results Immunohistochemistry stain demonstrated that the positive cells of cathepsin B was diffused in the cancer tissues with obvious stroma staining. The label index of BTCC tissues was obviously higher than that of normal tissues(P<0.01),and the label index is increased with the recurrence time(P<0.01). Conclusion The label index of high differentiation carcinoma is higher than that of low differentiation carcinoma. Cathepsin B staining of the normal bladder tissue is negative or only a few positive cells,but in the high grade and stage carcimoma tissues. The staining is positive and dispersed. Cathepsin B should be a good tool to determine the bladder tumor behavior and its prognosis.

Cathepsin B; Transitional cell carcinorma of bladder; Recurrence immunohistochemistry

南充市科技局资助项目(2010SF13)

李云祥，E-mail:liyunxiangwjsina.com

R 737.14

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.02.006

2014-10-10； 编辑： 张文秀)