桔酒降酸细菌的筛选及特性研究

戴小芳，刘　飞，侯志华，吴　梦，陈茂彬，镇　达（湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室/工业发酵湖北省协同创新中心，生物工程学院，湖北武汉430068）



桔酒降酸细菌的筛选及特性研究

戴小芳，刘飞，侯志华，吴梦，陈茂彬，镇达
（湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室/工业发酵湖北省协同创新中心，生物工程学院，湖北武汉430068）

摘要：为利用生物方法降低桔酒酸度，采用柠檬酸为碳源从各种来源分离有应用潜力的细菌菌株。通过桔酒降酸实验从14株初筛细菌中复筛得到1株优良菌株LF7，经鉴定为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。在完成桔酒乙醇发酵后，加入一定量LF7菌体并控制温度、氧气条件、糖度、酒精度及LF7接种量，这5种因素对降酸效果均有一定影响。降酸温度20℃、初始糖度16 g/L、酒精度5 %vol条件下发酵6 d，总酸含量可降低29.7 %。纸层析分析显示原酒中的柠檬酸完全被利用分解。

关键词：降酸细菌；桔酒；总酸；柠檬酸；果酒

不同柑橘果汁的酸度含量可达到5～16 g/L（以柠檬酸计），折合为酒石酸为5.8～18.8 g/L，远远超出国标GB 15037—2006《葡萄酒》中规定的滴定酸5.0～8.0 g/L（以酒石酸计）范围[1-3]。果酒中过高的有机酸会造成酒味过酸，酒体粗糙以致难以入口。桔酒中存在的有机酸主要为柠檬酸。有关果酒中柠檬酸降解的文献不多。赵玉平等[4]筛选到对山楂酒柠檬酸降解酵母，王立芳等[5]筛选到可同时降解苹果酸和柠檬酸的酵母。文献报道葡萄酒二次发酵中乳酸菌也可代谢柠檬酸，但是还没有针对柑橘酒柠檬酸降酸乳酸菌的相关报道。本研究采用以柠檬酸为碳源的MRS改良培养基进行初筛，从初筛的菌株中复筛获得1株疑似乳酸菌的细菌，该菌株在桔酒降酸中作用效果明显。实验对影响该菌降酸性能的条件及果酒有机酸成分变化进行了分析。

1　材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

材料：桔酒原酒（采用10月份湖北本地桔子经过25℃下发酵6 d获得。酸度以柠檬酸计为8.1 g/L、糖度16.0 g/L、酒精度5 %vol、总SO240 mg/L）；14株初筛菌株（利用以柠檬酸为主要碳源的MRS培养基从自然降酸果酒、酸奶、活菌饮料、泡菜汁、香蕉提子皮以及蔬菜叶中分离纯化得到）；市售白砂糖用于调整糖度。

试剂：L-苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、甲酸、正丁醇等，均为国药集团分析纯试剂。

仪器：立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安）；无菌操作台（上海智城）；分析天平、pH计（梅特勒-托利多）；移液枪（北京华美）；恒温培养箱（宁波莱福科技）。

1.2实验方法

1.2.1复筛

14株初筛菌菌体适量接入桔子酒原酒中密封，在20℃恒温培养箱中后发酵7 d左右。取上层酒液，测定总酸、柠檬酸残留量，对菌株进行简单染色后镜检。

1.2.2发酵条件对降酸效果影响实验

选取的可变因素为糖度、接种量、酒精度、温度及容器充满系数（氧气条件）。使用100 mL已灭菌的试管，双层保鲜膜密闭封口。除可变因素外都采取糖度16 g/L、酒精度5 %vol、接种量1×105cfu/mL、容器充满系数60 %、20℃下发酵6 d。降酸处理后的桔酒经15℃放置6 d（陈酿）后过滤，进行酸度、纸层析分析及感官品评。发酵条件的设置如下：（1）糖度，在原酒残糖基础上补加蔗糖，将原酒糖度调整为16 g/L、26 g/L、36 g/L、46 g/L、56 g/L；(2)接种量，从LF7斜面用原酒制备成菌悬液，分别取适量至原酒中，形成0.5×105～2.5×105cfu/mL共5个梯度；（3）酒精度，在原酒的酒精度基础上补加无水酒精，形成5 %vol～13 %vol的5个酒精度梯度；（4）发酵温度，设置10～30℃5个温度梯度；（5）容器充满系数，以容器装满为100 %，设定20 %～100 %共5个梯度。

1.2.3分析方法

糖度：果酒的残糖测定采用斐林试剂法；酸度：酸碱滴定法，以柠檬酸计；酒精度：酒精计法，蒸馏后测定；pH值：pH计法。

有机酸纸层析分析：展开剂为正丁醇∶甲酸∶水（80∶15∶5），标准品浓度（质量体积比）琥珀酸0.6 %、苹果酸0.4 %、柠檬酸0.28 %、乳酸0.8 %。样品及标准品均点样10µL，展开2 h左右，挥干溶剂后用溴甲酚紫乙醇溶液显色。

2　结果与分析

2.1不同条件对LF7菌株的降酸效果的影响

从多种来源分离纯化细菌，将这些初筛菌株接入原酒（见材料1.1）进行降酸处理，获得1株具有明显效果的菌株，命名为LF7。LF7分离于自然降酸桔酒中，在MRS培养基上显示直径约1 mm的乳白色菌落，镜检为杆状细菌，革兰氏染色阳性，27F及1492R引物扩增16S rDNA序列，产物1.5 kb左右。扩增产物经测序，在NCBI进行Microbial Nucleotide BLAST，显示与Lactobacillus plantarum WCFS1（NC_004567）等的16SrDNA序列一致性达到99 %，可以初步判断属于植物乳杆菌。LF7在MRS斜面上活化后制备菌悬液用于接种。

2.1.1酒样糖度对降酸效果的影响

在原酒中补加蔗糖以考察含糖量对LF7菌株降酸效果的影响。由图1可知，随着原酒中糖量的增加，酒样酸度也逐步提高。可能是原酒的糖分被LF7菌体或者杂菌利用产酸。本实验中的后续实验不再添加蔗糖，原酒糖度保持16 g/L。

图1 原酒糖度对LF7菌株降酸的影响

2.1.2 LF7接种量对降酸效果的影响

实验中酒样中加入的LF7菌体浓度为0.5×105～2.5× 105cfu/mL。降酸处理后检测酒样酸度，结果见图2，在整体趋势上，接种量越大，酒样酸度越低，说明增加接种量有助于降酸效果的提高。

图2 LF7菌株接种量对桔酒降酸的影响

2.1.3不同酒精度对LF7降酸效果的影响

酒精度实验在原酒5 %vol酒精度的基础上添加无水乙醇至理论酒精度为5 %vol、7 %vol、9 %vol、11 %vol、13 %vol，实验结果见图3。随着酒精度的提高，降酸效果整体呈现下降趋势，在13 %时下降明显，说明酒精度过高，不利于LF7的降酸作用。

图3 原酒酒精度对LF7降酸效果的影响

2.1.4不同处理温度对LF7降酸效果的影响

考虑到过高的温度对果酒质量的影响，实验温度选择10℃、15℃、20℃、25℃、30℃。实验结果见图4。结果显示，随着温度的上升，酸度显著下降，说明LF7菌体活性增加，提高了降酸效果。20℃时降酸效果已经比较理想，适于果酒的降酸处理。

图4 降酸温度对LF7降酸效果的影响

2.1.5氧气条件对LF7降酸效果的影响

采用容器充满系数设定不同的氧气条件。容器充满系数设定为20 %～100 %。实验结果见图5，系数越低，酒的酸度越低，说明较好的氧气条件有利于LF7的降酸作用。在给与更多氧气时，降酸效果可能更好。考虑到充分利用容器及氧气对果酒品质的影响，在实际应用时可采用容器适当密封的方法控制氧气的暴露程度。

图5 氧气条件对LF7降酸效果的影响

2.2降酸果酒样品的纸层析分析

通过纸层析，比较果汁、原酒及降酸果酒样品中的主要有机酸成分及其变化。降酸果酒样品的制备条件为：原酒酒精度5 %vol，糖度16 g/L，降酸温度20℃，降酸处理6 d。总酸测定结果显示，较未加LF7的对照样，处理样品总酸降低约30 %。由图6可知，标准品中，琥珀酸与乳酸Rf值相近，难以区分，其他3种标准品容易辨别。桔汁的有机酸以柠檬酸为主，含较少的琥珀酸，与文献报道一致[6]；原酒中以柠檬酸为主，琥珀酸或乳酸含量较果汁有所下降。而所有果汁及果酒样品中基本上未出现苹果酸，而且在点样起点不远处有少量其他有机酸成分，这可能与该桔子品种有关[7]。以原酒为原料降酸后，柠檬酸已经基本消失，而琥珀酸/乳酸含量增加较明显。因为琥珀酸很少作为发酵产物积累，推测降酸后增加的部分应该是乳酸。根据文献报道，葡萄酒的苹果酸乳酸发酵中，柠檬酸也会平行地得以降解，有些乳酸菌的作用会产生较多的乙酸。如果LF7菌株转化柠檬酸为乳酸而不是以乙酸为主，这对桔酒品质是有利的。

注：前4个为标准品，后4个为果汁及果酒样品。图6 果酒样品主要有机酸纸层析分析

3　结论

以柠檬酸为碳源，从食品样品中筛选出能利用柠檬酸的细菌菌株，通过接种量、初始糖度、酒精度、氧气和温度等条件的实验，显示都对降酸效果有影响。在原酒酒精度5 %vol、糖度16 g/L、降酸温度20℃条件下，处理6 d后酸度为5.7 g/L（以柠檬酸计），较原酒酸度下降29.7 %。纸层析分析结果显示，该降酸过程中柠檬酸被完全降解和转化，经感官品评降酸酒样具有酸度适宜、果香纯正、酒香协调的特点。

研究中采用了16 g/L残糖的原酒。根据实验结果分析，残糖水平影响降酸效果，因此，如果进一步在更低（＜4 g/L）糖度下进行降酸处理，降酸效果可能更好。另外，pH值对降酸的影响在苹果酸乳酸发酵中非常重要，一般认为，pH3.2～3.8时可以有效实现苹果酸乳酸发酵。本研究中，桔酒pH值一般保持在3.5～3.6，实验采用的原酒pH3.58。在该pH值条件下，采用LF7降酸能表现出良好的降酸效果。

参考文献：

[1]王贵元,倪丽.荆州地区6个柑橘品种成熟期果实品质的比较[J].天津农业科学, 2014,20(1)：99-101.

[2]潘晓飚,冯春梅,莫云彬,等.高橙果酒降酸技术研究[J].酿酒科技,2006(7)：65-67.

[3]朱莲珍,沈治平.中国主要柑桔品种的营养成分[J].营养学报, 1957,2(1)：61-69.

[4]赵玉平,杜连祥,刘丽丽,等.降解山楂汁中柠檬酸酵母菌的筛选及其降解特性研究[J].微生物学报, 2004, 44(2)：235-239.

[5]王立芳,张微,文连奎.可降解L-苹果酸和柠檬酸菌株的筛选及鉴定[J].食品科学, 2010,31(21)：279-282.

[6]张规富,谢深喜.柑橘果实柠檬酸代谢研究进展[J].中国园艺文摘, 2012(8)：1-3.

[7]赵淼,吴延军,蒋桂华,等.柑橘果实有机酸代谢研究进展[J].果树学报, 2008,25(2)：225-230.

Screening of a Deacidifying Bacterial Strain for Orange Wine & Study on Its Properties

DAI Xiaofang, LIU Fei, HOU Zhihua, WU Meng, CHEN Maobin and ZHEN Da
（Key Lab of Fermentation Engineering of Ministry of Education, Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan, Hubei 430068, China）

Abstract：In order to achieve the deacidification of orange wine by biological method, 14 bacterial strains with application potentials were preliminarily separated from various sources using citric acid as substrate in MRS medium. Then a quality strain LF7 was screened out through orange wine deacidification test and it was identified as Lactobacillus plantarum. A certain amount of LF7 was inoculated after the fermentation of orange wine and five factors including temperature, oxygen conditions, sugar content, alcohol content, and LF7 inoculating quantity would influence the acidification of orange wine. As the temperature was at 20℃, initial sugar content was 16 %, and alcohol content was 5 %vol, total acids dropped by 29.7 % after 6 d fermentation. Paper chromatography analysis showed that citric acid in wine sample was decomposed thoroughly.

Key words:deacidifying bacteria; orange wine; total acid; citric acid; fruit wine

通讯作者：镇达（1968-），男，湖北松滋人，副教授，E-mail：davezhen2010@163.com。

作者简介：戴小芳（1992-），女，大学本科。

收稿日期：2015-10-08；修回日期：2016-01-17

DOI：10.13746/j.njkj.2015392

中图分类号：TS262.7；TS261.4；TS261.1

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016)04-0059-03

优先数字出版时间：2016-03-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160304.1339.003.html。