兼香型白酒不同轮次及操作的酒醅细菌种类与数量分析

熊小毛，刘俊超，缪礼鸿，刘蒲临（.湖北白云边酒业股份有限公司,湖北松滋43400；.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉43003）



兼香型白酒不同轮次及操作的酒醅细菌种类与数量分析

熊小毛1，刘俊超2，缪礼鸿2，刘蒲临2
（1.湖北白云边酒业股份有限公司,湖北松滋434200；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

摘要：采用稀释平板分离法和细菌16S rDNA序列同源比对方法，对白云边机械化班组和传统班组第1轮至第7轮入池前堆积料及第3轮至第7轮出池酒醅中细菌的数量和种类进行了分析比较。结果表明，机械化班组和传统班组的前5轮入池堆积料中细菌活菌数均随着发酵轮次的增加而不断减少。从机械化和传统工艺组的酒醅中共分离获得36株细菌，将这些细菌鉴定为1个属4个种，分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。不同轮次的白云边机械化班组和传统班组酒醅中的主要细菌均为B.amyloliquefaciens和B.licheniformis，表明这2种芽孢杆菌是白云边酒醅中的优势细菌。从2种操作工艺的酒醅中分离的细菌群落结构无明显差异。

关键词：兼香型白酒；生产工艺；酒醅；细菌群落；白酒

细菌是中国传统大曲酒生产过程中的重要微生物，在大曲、高温堆积料、发酵酒醅以及窖泥中均有多种细菌存在并发挥作用。有研究表明这些参与白酒酿造的细菌中以芽孢杆菌类细菌为主[1-2]。这些芽孢杆菌能够产生淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等多种酶类，同时也被认为是白酒酱香风味物质形成的关键[3-5]。

本研究对兼香型白云边大曲酒机械化酿酒车间和传统酿酒车间不同轮次的入池前堆积料以及出池酒醅中的细菌种类和数量进行了对比分析，旨在解析机械化与传统操作工艺对不同轮次白云边酒醅细菌种类及数量的影响，为传统白酒的生产调控及机械化酿酒工艺的应用提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1样品采集

分别采集湖北白云边酒业股份有限公司机械化摊晾操作酿酒车间和传统操作酿酒车间的第1轮次至第7轮次的入窖池前堆积料和第3轮次至第7轮次出窖池酒醅。入池前分表层和里层（距表层20 cm）取样，每层选取同一水平面的4个位置点各100 g，混匀；出池分上、中、下层取样，每层选取同一水平面的5个位置点各100 g，混匀。

1.1.2培养基

细菌分离培养基：牛肉膏-蛋白胨培养基[6]；MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖5 g，吐温80取1 g，磷酸氢二钾2 g，醋酸钠5 g，柠檬酸二胺2 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，蒸馏水1000 mL，pH6.5～6.8。配制固体平板时添加2 %琼脂粉。

1.1.3主要试剂

菌株DNA提取、16S rDNA片段扩增所用的酶、Marker、dNTPs、Buffer等购于生工生物上海股份有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2实验方法

1.2.1细菌分离方法

称取10 g酒醅或发酵堆积料，置于装有90 mL无菌水的三角瓶中，170 r/min摇床5 min后，采用稀释平板法分别涂布于牛肉膏蛋白胨平板及MRS平板上，分别置于30℃和37℃生化培养箱中培养2 d，计数，取单菌落经划线分离纯化（其中的单菌落均为每一轮次的优势细菌菌落）、镜检，编号后保存备用。

1.2.2细菌活菌数测定方法

采用稀释平板测数法[6]。分别将采集到的白云边酒醅及发酵堆积料用无菌水浸出，按照不同梯度稀释，取不同稀释度的样液各100 μL分别涂布于牛肉膏-蛋白胨平板上，置于37℃培养箱中进行培养，2 d后记数平板上细菌菌落数。

1.2.3细菌DNA的提取

将分离到的细菌菌株在牛肉膏蛋白胨平板上活化并多次划线纯化后接种到LB液体培养基中于37℃、170 r/min下摇瓶培养14 h，用细菌基因组抽提试剂盒提取基因组DNA，检测后置于-20℃下保存备用。

1.2.4 16S rDNA的PCR扩增和测序

以细菌基因组DNA为模板作PCR扩增16S rDNA，扩增引物采用通用引物16S-27F（5'-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3'）和16S-1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR反应体系采用50 μL反应体系，其中引物27F/1492R各1 μL，Premix Taq（2×）25 μL，模板DNA 1 μL，无菌双蒸水22 μL。PCR循环程序为：94℃预变性5 min，94℃50 s，54℃50 s，72℃1 min 30 s；循环30次；72℃延伸10 min。

1.2.5构建细菌系统发育树

扩增的PCR产物送金唯智生物科技（北京）有限公司测序，测序长度1500 bp左右，测序结果采用DNAstar软件序列图谱人工校对拼接，拼接后的序列在NCBI核酸序列数据库中进行同源序列搜索比对，比较测试菌株和已知细菌菌株之间的亲缘关系及系统地位。根据同源序列搜索结果，选取测试菌株关系较近的模式菌株的16S rDNA序列，用MEGA5.0软件采取邻接法Neighborjoining，进行1000次Bootstrap计算后构建系统发育树。

注：1为JRB3-2；2为JRB4-1；3为JRB4-2；4为JRB3-3；5为JRB2-1。图1 代表性细菌16S rDNA的PCR扩增凝胶电泳图

2　结果与分析

2.1白云边酒醅细菌菌株的分离鉴定

细菌16S rDNA扩增结果。利用细菌基因组抽提试剂盒提取的DNA为模板，进行PCR扩增得到的结果见图1。1～5号细菌扩增条带大小均在1500 bp左右，可以判断已经成功扩增出该目标菌株的16S rDNA片段。

2.2不同操作工艺酿酒车间细菌分类鉴定结果

2.2.1机械化酿酒车间分离细菌的系统分类

从机械化酿酒车间第1轮次至第7轮次入池前堆积料和第3轮次至第7轮次出池酒醅中共分离出20株细菌，根据16S rDNA序列同源性构建的细菌系统发育树见图2。这20株细菌与GenBank中芽孢杆菌属的3种模式菌种（B.amyloliquefaciens、B.licheniformis和B.methylotrophicus）的序列相似度均≥99 %，其中13株为B.amyloliquefaciens，占所分离细菌总数的65.0 %；6株为B.licheniformis，占细菌总数的30.0 %；1株为B.methylotrophicus,占细菌总数的5.0 %。表明B.amyloliquefaciens和B.licheniformis为机械化酿酒车间酒醅中的优势细菌。

2.2.2传统酿酒车间分离细菌的系统分类

图2 20株机械化酿酒车间细菌基于16S rDNA基因序列的系统发育树

图3 16株传统酿酒车间细菌基于16S rDNA基因序列的系统发育树

从传统酿酒车间第1轮次至第7轮次入池前堆积料和第3轮次至第7轮次出池酒醅中共分离出16株细菌，根据细菌16S rDNA序列的同源性构建的系统发育树见图3。

由图3可知，这16株细菌与GenBank中的芽孢杆菌属的3种模式菌种（B.amyloliquefaciens、B.subtilis和B. licheniformis）的序列相似性均≥99 %，其中B.amyloliquefaciens有9株，B.licheniformis有6株，B. subtilis有1株，分别占所分离细菌总数的56.3 %、37.5 %和6.3 %。表明B.amyloliquefaciens和B. licheniformis为传统酿酒车间的优势细菌，这与机械化酿酒车间分离到的细菌种类及所占比例相似。

2.3机械化酿酒工艺和传统酿酒工艺对细菌数量的影响

2.3.1机械化操作班组和传统操作班组入池前堆积料中细菌活菌数的比较

第1轮次至第7轮次机械化组和传统组入池前表层堆积料中细菌活菌数的比较结果见图4。由图4可知，第1轮次至第3轮次和第5轮次机械化组入池前堆积料中细菌活菌数多于传统组中细菌活菌数，第4轮次、第6轮次、第7轮次则传统组中细菌活菌数多于机械化组中细菌活菌数。

第1轮次至第7轮次机械化组和传统组入池前里层堆积料中细菌活菌数的比较结果见图5。由图5可知，第1轮次、第2轮次机械化组中细菌活菌数多于传统组中细菌活菌数，第3轮次至第7轮次则表现为传统组中细菌活菌数多于机械化组中细菌活菌数。

图4 机械化组和传统组入池前表层堆积料中细菌活菌数的比较

图5 机械化组和传统组入池前里层堆积料中细菌活菌数的比较

2.3.2机械化操作班组和传统操作班组出池酒醅中细菌活菌数的比较

第3轮次至第7轮次机械化组和传统组出池上层酒醅中细菌活菌数的比较结果见图6。由图6可知，第3轮次、第4轮次机械化组细菌活菌数多于传统组的细菌活菌数，第6轮次、第7轮次则表现为传统组细菌活菌数多于机械组的细菌活菌数，第5轮次机械组和传统组细菌活菌数相差不多。

第3轮次至第7轮次机械化组和传统组出池中层和下层酒醅中细菌活菌数的比较结果分别见图7和图8。由图7和图8可知，第3轮次、第4轮次机械化组中层和下层酒醅的细菌活菌数均多于传统组，第6轮次、第7轮次则表现出传统组细菌活菌数均多于机械组，第5轮次机械组和传统组的细菌数相差不多。

2.4不同轮次及操作工艺入池和出池酒醅细菌种类的比较

图6 机械化组和传统组出池上层酒醅中细菌活菌数的比较

图7 机械化组和传统组出池中层酒醅中细菌活菌数比较

图8 机械化组和传统组出池下层酒醅中细菌活菌数比较

第1轮次至第7轮次机械组和传统组入池前堆积料中分离的细菌种类及分布比较结果见表1。由表1可知，机械组和传统组第1轮次至第7轮次入池前堆积料中占优势的细菌主要是B.amyloliquefaciens和B.licheniformis。从每轮次入池前堆积料中均只分离到2种芽孢杆菌。除第1轮次外，几乎在2个操作班组的每个轮次的入池堆积料中均能分离到B.amyloliquefaciens，而B.subtilis仅在第4轮次传统组的入池堆积料中出现过1次。

第3轮次至第7轮次机械组和传统组出窖池酒醅中细菌种类及分布比较结果见表2。由表2可知，2种工艺组的出池酒醅中的细菌主要也是B.amyloliquefaciens和B.licheniformis，与入池料中的细菌种类相同，表明其具有相同的来源，并且这2种芽孢杆菌具有较强的耐受能力，是酒醅中的优势细菌。

3　讨论

本研究从白云边机械化和传统酿酒车间不同轮次的酒醅中共分离获得36株细菌，经细菌系统分类鉴定它们均属于芽孢杆菌属。从细菌种类上看，仅出现4种芽孢杆菌，比预期的细菌种类要少，可能是由于所分离到的4种细菌在数量上大大超过可能存在的其他种类细菌，导致占少数的细菌在分离过程中被稀释掉而未能出现在平板上。为了获得更多种类的细菌，选择适当的富集培养方法有待进一步研究。

表1 第1轮次—第7轮次机械化组和传统组入池前堆积料中细菌种类比较

表2 第3轮次—第7轮次机械化组和传统组出池酒醅中细菌种类比较

从总体上看，无论是机械化组还是传统组，前5轮次入池堆积料中的细菌活菌数均随着发酵轮次的增加而不断减少，第6轮次至第7轮次的细菌活菌数又有所上升。不同轮次的出池酒醅的细菌活菌数均比其入池酒醅细菌数明显减少，其中第5轮次和第6轮次出池酒醅中的细菌活菌数最低，相反，这2个轮次酒醅的出酒率和酵母菌活菌数均最高（待发表），表明酒醅中微生物的群落结构和数量与白酒产量和品质密切相关。不同轮次的白云边机械化组和传统组的入池和出池酒醅中的主要细菌均为B.amyloliquefaciens和B.licheniformis，表明这2种芽孢杆菌是白云边酒醅中的优势细菌。2种操作工艺的白云边酒醅细菌群落结构没有明显差异。

白云边大曲酒采用高温制曲、高温堆积、多轮发酵工艺。前期研究表明，白云边酒高温堆积过程中的细菌主要为B.amyloliquefaciens、B.subtilis、B.velezensis、B. licheniformis等芽孢杆菌属[7]，与白云边高温大曲中的优势细菌种类相同[8]，表明白云边酒醅中的芽孢杆菌主要来源于其高温大曲。B.amyloliquefaciens和B.licheniformis能够在白云边高温堆积料和出池酒醅中均占优势，可能与B.amyloliquefaciens和B.licheniformis具有较好的耐乙醇和耐高温能力有关[9-11]。

有研究报道称B.amyloliquefaciens和B.licheniformis能够产生四甲基吡嗪、2-戊基呋喃等多种香味物质成分，与酱香型白酒风味物质的形成相关[12-16]。通过高温制曲、高温堆积发酵工艺富集占优势的芽孢杆菌，酿造出具有酱香风味的中国传统白酒，它们之间形成了必然的因果关系。白云边酒为浓酱兼香型，其酱香风味物质的形成可能与这2种在酒醅中占优势的芽孢杆菌相关。

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Analysis of the Species and Quantities of Bacteria in Fermented Grains of Jianxiang Baijiu in Different Production Round

XIONG Xiaomao1, LIU Junchao2, MIAO Lihong2and LIU Pulin2
(1. Hubei Baiyunbian Liquor Co. Ltd., Songzi, Hubei 434200; 2.School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan, Hubei 430023, China）

Abstract:In this study, the species and quantities of bacteria in fermented grains of Baiyunbian Liquor before pit-entry from the 1st production round to the 7th production round/ after pit-exit from the 3rd production round to the 7th production round (both in mechanized operation workshop and in traditional operation workshop) were analyzed and compared using dilution plate count and 16S rDNA sequencing and homologous analysis. The results showed that, the quantities of live bacteria in fermented grains in the first five production rounds kept decreasing with the increase of fermentation round in both mechanized operation workshop and traditional operation workshop. 36 bacteria strains in total were isolated from fermented grains in the two workshops, and those bacteria strains were classified into four species including Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis and Bacillus methylotrophicus. B.amyloliquefaciens and B.licheniformis were the dominant bacteria species in both workshops, suggesting the two strains were the predominant bacteria in Baiyunbian fermented grains. Besides, there was no significant difference in bacteria colony structure from both workshops.

Key words:Jianxiang Baijiu; production techniques; fermented grains; bacteria colony; Baijiu

通讯作者：缪礼鸿（1965-），男，博士，教授，E-mail：miaowhpu@126.com。

作者简介：熊小毛（1960-），男，湖北天门人，教授级高级工程师，从事科学研究、技术开发、质量管理工作30余年，取得多项科研成果，第一批享受国务院津贴者，全国劳动模范、国家白酒协会专家委员会专家，现任湖北白云边酒业股份有限公司常务副总经理、总工程师。

收稿日期：2015-12-24

基金项目：湖北省重大科技创新计划项目资助（2013ABA008）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015479

中图分类号：TS262.3；TS261.4；TS261.1

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）04-0030-05

优先数字出版时间：2016-02-02；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160202.1335.003.html。