黄酒酿造过程中优势细菌产生物胺的检测与评价

张凤杰，王德良，薛　洁，闫寅卓（中国食品发酵工业研究院，北京100027）



黄酒酿造过程中优势细菌产生物胺的检测与评价

张凤杰，王德良，薛洁，闫寅卓
（中国食品发酵工业研究院，北京100027）

摘要：采用显色培养基法、脱羧酶序列特异PCR技术和HPLC分析脱羧酶液体培养基生物胺含量变化3种方法检测和评价来自黄酒酿造过程的41株细菌产生物胺的情况。研究表明，3种方法检测结果大致相同，互补使用能够准确分析细菌产生物胺的情况；41株细菌中，53.7 %以上都能产酪胺，31.7 %以上产腐胺，24.3 %以上产组胺；14株短乳杆菌均携带酪氨酸脱羧酶基因，其中11株菌的酪胺产量超过50.00 mg/L，且多数菌能代谢产生多种生物胺，因此推断其对黄酒中生物胺含量影响最大；细菌代谢是否产生物胺及产生物胺的能力无种属特异性，但有菌株特异性。

关键词：黄酒；细菌；生物胺；显色培养基；PCR；HPLC

黄酒酿造采用开放式的工艺形式，酿造过程中微生物种类和数量繁多，细菌群落结构复杂，参与发酵过程的细菌主要有乳酸菌、醋酸菌、芽孢杆菌、糖多孢菌、葡萄球菌等，还有一些不可培养的细菌[1-2]。微生物的多种代谢产物对于黄酒风味和品质有重要影响[3]，然而，这也会使黄酒中含有一些微量有害物质，如氨基甲酸乙酯（ethylcarbamate，EC）[4-5]、生物胺（Biogenic amines，BAs）[6]等。

生物胺是一类具有生物活性的含氮低分子量有机化合物的总称，普遍存在于多种食品中，其中毒性最大的是组胺，其次是酪胺[7]。生物胺生成需要3个条件：（1）生物胺前体物质游离氨基酸；（2）微生物及适合微生物生存的条件；（3）发生脱羧反应的条件。腐胺是黄酒中含量最大的胺，腐胺、酪胺和组胺的平均含量分别为37.201 mg/L、 25.294 mg/L和6.173 mg/L[8]。黄酒中生物胺主要来自酿造过程，丰富的氨基酸和乳酸菌的存在是生物胺增加的主要原因[9-10]，酿造过程中的微生物代谢产生脱羧酶，该酶催化相应的游离氨基酸脱去羧基生成生物胺。氨基酸作为产品价值的一部分而大量存在于黄酒中，所以控制黄酒中生物胺含量的关键在于控制酿造过程中能够产生生物胺的微生物种类和数量。

因此，本研究采用显色培养基法、脱羧酶序列特异PCR检测法和HPLC分析生物胺含量变化法这3种方法，筛查黄酒酿造过程中优势细菌的产胺情况，重点评价其产组胺、酪胺和腐胺的能力。探究产生物胺菌株有无共性差异，为进一步控制黄酒中生物胺含量提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

菌株：实验室保藏的41株细菌，分离源均为黄酒生产过程。

生物胺检测培养基[11]：MRS培养基中添加5'-磷酸吡多醛0.05 g/L，溴甲酚紫0.06 g/L，琼脂20 %，分别添加L-组氨酸1.0 g/L、L-酪氨酸0.4 g/L制成组胺检测平板、酪胺检测平板和腐胺检测平板。

生物胺检测液体培养基：MRS培养基中添加5'-磷酸吡多醛0.05 g/L，溴甲酚紫0.06 g/L，添加L-组氨酸1.0 g/L、L-酪氨酸0.4 g/L、L-鸟氨酸1.0 g/L。

化学试剂：8种单体生物胺标样（色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺），1,7-二氨基庚烷（内标），丹磺酰氯(衍生剂)，均为Sigma公司产品；三氯甲烷，正丁醇，丙酮，甲醇，均为色谱纯；乙醚，谷氨酸钠，乙酸钠，碳酸氢钠，氯化钠，盐酸等；5'-磷酸吡哆醛（辅酶），溶菌酶，北京陆桥技术有限责任公司；DP302细菌基因组提取试剂盒，2×Tap mastermix，天根生化；琼脂糖，Biowest Agarose；EB，Sigma等。

仪器设备：高效液相色谱仪，Perkin Elmer Series 200，紫外检测器；安捷伦C18色谱柱（5µm，150 mm×4.6 mm）；氮吹仪；温度梯度PCR仪，美国ABI公司；凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司；电泳仪，北京六一仪器厂；MiniSpin个人型高速离心机，德国Eppendorf；立式电压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；LRH-250生化培养箱，上海恒科仪器有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面超净工作台，苏州净化设备有限公司等。

1.2实验方法

1.2.1显色培养基法检测产胺菌

将细菌分别划线于相应的3种生物胺检测平板，30℃培养5 d，记录颜色变化，结果以黄色为阴性，紫红色或紫色为阳性。

1.2.2特异序列PCR扩增检测产胺细菌

细菌DNA提取：菌株接种于MRS培养基中30℃活化12 h，吸取1 mL菌液，8000 r/min离心5 min收集菌体，用无菌水洗涤2次，加入50 μL双蒸水重悬菌体，制成菌悬液。按照天根DP302细菌基因组提取试剂盒说明提取细菌基因组。

引物：酪氨酸脱羧酶引物TD2(5'-ACTTAGTCAACCATRTTGAA- 3')/ TD5(5'- CAAATGGAAGAAGAAGTAGG-3')，目标片段1132 bp；组氨酸脱羧酶引物HDC1 (5'-ATGTCAGAGTTTGATAAAAAG-3')/HDC2(5'-TTAATAATTGATGTTTCCACC-3')，目标片段904 bp。

25μL反应体系：2×Tapmastermix12.5μL，引物(10μM) 各1 μL，模板DNA2 μL，加双蒸水补足至25 μL。

PCR反应条件：95℃预变性，5 min；循环次数30次；95℃变性，30 s，52℃退火，1 min，72℃延伸，2 min；72℃终延伸，10 min。

本实验选用已报道的组氨酸和酪氨酸脱羧酶基因扩增引物序列，由生工生物工程（上海）有限公司合成，按照上述25 μL反应体系和PCR反应条件分别对组氨酸脱羧酶基因和酪氨酸脱羧酶基因进行序列扩增，扩增产物经1.2 %的琼脂糖凝胶电泳检测，4℃保存。

1.2.3 HPLC法分析细菌产胺情况

菌株接种于MRS培养基活化18 h，然后接种于添加氨基酸和辅酶的改良MRS生物胺检测培养基，30℃培养5 d后检测培养液中的腐胺、酪胺和组胺含量，以不接种的培养基作空白。

2　结果与分析

2.1显色培养基检测产胺细菌

将41株细菌分别划线于组胺、腐胺和酪胺检测平板上，30℃培养，记录颜色变化，如图1，可以明显观察到黄色与紫色（紫红）的对比。随着培养时间的延长，平板颜色逐渐出现变化，且颜色变化与生长时间和菌苔量均有关：不同菌株出现颜色变化的时间不同；已经出现颜色变化的培养基随时间变化颜色更加鲜明（即黄色更黄，紫红色更深）；所有菌株在培养5 d后，颜色不再变化。

41株细菌检测结果汇总见表1，结果表明：41株菌中，产组胺、酪胺和腐胺的比例分别为39.0 %、56.1 %和31.7 %，7株菌的3种胺检测平板均为阴性；14株短乳杆菌中5株产组胺、7株产酪胺、6株产腐胺；6株干酪乳杆菌中3株产组胺、4株产酪胺、4株产腐胺；6株植物乳杆菌中3株产组胺、2株产酪胺、2株产腐胺；8株罗旺促杆菌中3株产组胺、7株产酪胺，但无菌株产腐胺；L4和L23检测结果为产组胺和酪胺，不产腐胺；L47和L2检测只产酪胺。产胺的菌株无菌种、菌属特异性，但有菌株特异性。

图1 生物胺检测平板结果

2.2特异序列PCR扩增检测产组胺和酪胺细菌

酪氨酸脱羧酶基因和组氨酸脱羧酶PCR扩增条带的电泳图如图2，扩增条带与目标条带大小相符，且条带清晰，方法稳定，说明该方法可用于检测组胺和酪胺产生菌。41株菌的PCR检测结果见表1。结果表明：41株菌中，产组胺、酪胺的比例分别为24.4 %和53.7 %，15株菌的酪氨酸脱羧酶和组氨酸脱羧酶的扩增结果均为阴性；10株菌携带组氨酸脱羧酶基因，其中14株短乳杆菌中6株检出，6株干酪乳杆菌中3株检出，另有1株罗旺醋杆菌；23株菌携带酪氨酸脱羧酶基因，14株短乳杆菌全部检出，6株干酪乳杆菌中3株检出，6株植物乳杆菌中4株检出，另有1株罗旺醋杆菌和1株戊糖片球菌。其他菌检测不到目标条带。综上分析，短乳杆菌携带这2种脱羧酶基因的比例最大。

注：左为tdc引物TD2/ TD5，右为hdc引物HDC1/ HDC2；M.maker DL2000；泳道1～9依次为L2、L3、L5、L6、L7、L36、L37、L40、L46 PCR产物。图2 细菌酪氨酸脱羧酶基因和组氨酸脱羧酶扩增序列电泳图

2.3 HPLC法分析细菌产胺能力

按照1.2.3方法对41株分离菌的产生物胺的能力进行初步评价，检测结果见表1和表2。结果表明：41株菌中，产组胺、酪胺和腐胺的比例分别为26.8 %、87.8 %和43.9 %，2株菌的3种培养基中未检出3种胺；醋杆菌和芽孢杆菌不产生组胺，只有1株片球菌L4产生少量组胺，28株乳杆菌中有2株菌产组胺含量在2.00～10.00 mg/L，另外有8株乳杆菌也产生少量组胺；41株细菌中产酪胺的细菌数最多，只有4株不产酪胺，产酪胺最多的菌集中在短乳杆菌，有10株短乳杆菌产酪胺的量超过50.00 mg/L，2株干酪乳杆菌、2株植物乳杆菌和2株芽孢杆菌产酪胺的含量在10.00～50.00 mg/L之间；产腐胺的菌也多属于乳酸菌，尤其是短乳杆菌和干酪乳杆菌。

综上分析，细菌产生物胺的能力无种属特异性，但短乳杆菌中产生物胺的菌株数量和生物胺含量高的菌株数量都比其他菌种大；细菌产生物胺的能力有菌株特异性，即同种属不同菌株产生物胺的能力不同。

2.4检测产胺微生物的方法比较

显色培养基法、特异序列PCR法和HPLC法检测41株产胺微生物，检测结果进行对比，见表1。显色培养基检测结果表明，23株菌中至少1种胺的检测平板为阳性；PCR快速检测结果表明，25株菌携带组氨酸或酪氨酸脱羧酶基因，HPLC法表明39株菌的培养液检测至少含有1种胺。3种检测方法结果不完全相符，但大致相同，说明3种方法有各自的优点和缺陷性，互补使用能够准确分析待测细菌产生物胺的情况。

3种检测方法各有利弊。显色培养基法受显色剂、pH值、氧气等诸多因素影响，容易出现假阳性和假阴性现象，但检测周期短，操作简单，成本低，可以作为初步筛查乳酸菌产胺情况的手段。PCR检测技术快速、简便，但检测到的阳性菌仅说明其携带脱羧酶基因，具有产生物胺的潜在可能性，但基因是否表达和脱羧酶是否具有活性都是不确定的，因此此方法是具有前瞻性的方法。HPLC法可以直接分析培养液中的生物胺种类和含量，比较各菌株之间的产胺能力，但仅能说明在某一特定条件下的细菌产胺情况，受培养基质等诸多因素的影响。

3　小结与讨论

表1 41株细菌产胺能力的3种方法检测结果

细菌代谢是否产生物胺及产生物胺的能力无种属特异性，但有菌株特异性。

细菌代谢氨基酸产生相应生物胺应是黄酒生物胺的主要来源，尤其是乳酸菌。短乳杆菌从产生物胺的菌株数量比和产胺能力强的菌株数量比来看都是对黄酒生物胺影响最大的菌株，且短乳杆菌产酸有恶臭[2]，会影响黄酒的风味品质。

芽孢杆菌和醋酸菌为黄酒酿造有害菌，因此应严格控制。乳酸菌是黄酒酿造过程中必不可少的微生物，也是黄酒生物胺的主要来源。研究发现，许多乳酸菌不产生物胺或只产生少量毒性较小的生物胺，如干酪乳杆菌L37。另外，已有报道许多细菌能降解生物胺，这些细菌代谢产生胺氧化酶，催化生物胺生成醛[12-13]。因此，高效利用此类无氨基酸脱羧酶活性或胺氧化酶活性较大的优良乳酸菌，实现混合菌株的现代化和机械化发酵形式，是解决黄酒生物胺安全问题最有效和最根本的措施，如生物酸化浸米[14-15]。但目前黄酒酿造技术相对落后，要想实现现代化发酵形式存在很多困难，也需要更加深入的研究。

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Detection of Biogenic Amines Produced by Predominant Bacteria in Yellow Rice Wine Brewing Process

ZHANG Fengjie, WANG Deliang，XUE Jie and YAN Yinzhuo
(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100027,China)

Abstract:The change of biogenic amines (produced by 41 bacteria strains in yellow rice wine brewing process) content in decarboxylase liquid culture medium was analyzed by three methods including chromogenic medium method, decarboxylase sequence specific PCR and HPLC. The results showed that the three methods obtained similar results, and the complementary use of the three methods could accurately analyze biogenic-amines-producing status as follows: over 53.7 % of 41 bacteria strains could produce tyramine, over 31.7 % of them could produce putrescine and over 24.3 % of them could produce histamine; 14 strains of Lactobacillus brevis were carrying a tyrosine decarboxylase gene and tyramine yield from 11 strains of them exceeded 50.00 mg/L, and most of them could produce various biogenic amines (it could be inferred that those bacteria strains had the strongest influence on biogenic amines content in yellow rice wine); whether bacterial metabolism produced biogenic amines was not species-specific, but strains-specific.

Key words:yellow rice wine; bacteria; biogenic amines; chromogenic medium; PCR; HPLC

作者简介：张凤杰，女，硕士，工程师，主要从事黄酒酿造研究，E-mail：zhangfengjie86@126.com。

收稿日期：2015-11-16

基金项目：科技部院所基金项目（2014EG111217），国家自然科学基金青年基金（31401680）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015436

中图分类号：TS262.4；TS261.4；TS261.1

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）04-0017-04

优先数字出版时间：2016-02-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160225.1742.007.html。