己酮可可碱对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜微循环影响的实验研究

王冬　李勇　徐保利　赵群　范立侨　张志栋　檀碧波　崔平

050011　石家庄市，河北医科大学第四医院外三科(王冬、李勇、徐保利、赵群、范立侨、张志栋、檀碧波)；河北省人民医院医务处(崔平)



·论著·

己酮可可碱对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜微循环影响的实验研究

王冬李勇徐保利赵群范立侨张志栋檀碧波崔平

050011石家庄市，河北医科大学第四医院外三科(王冬、李勇、徐保利、赵群、范立侨、张志栋、檀碧波)；河北省人民医院医务处(崔平)

【摘要】目的讨己酮可可碱对重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis,SAP)大鼠肠黏膜微循环的影响及意义。方法SD大鼠96只随机分为假手术(SO)组、胰腺炎(SAP)组、己酮可可碱(PTX)治疗组。建立大鼠SAP模型。3组于2、6、12、24 h 4个时相观察腹水量及胰腺病理变化、肠黏膜微血管管径、流速。检测3组血浆内毒素(LPS)和血清淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIP)水平。结果腹水量、胰腺病理评分各时相SAP组与SO组差异有统计学意义(P<0.05)；PTX组与SAP组相比各指标变化程度较小(P<0.05)。SAP组、PTX组与SO组比较，肠黏膜微血管管径减小、血流速度减慢(P<0.05)。SAP组、PTX组LPS、AMY、LIP水平明显高于SO组(P<0.05)；PTX组血液指标均低于SAP组(P<0.05)。结论己酮可可碱可有效改善SAP时肠黏膜的微循环。

【关键词】重症急性胰腺炎；肠损伤；微循环；己酮可可碱；大鼠

急性重症胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)病情凶险、预后差[1,2]。SAP发生时患者出现的胰腺外脏器损伤是导致患者死亡的重要原因。在这些脏器中，肠黏膜损伤造成的危害不容忽视[3,4]。肠道是人体最大的细菌库，SAP时往往伴有肠屏障功能障碍。SAP时发生肠黏膜水肿,肠黏膜上皮细胞凋亡数量增加、上皮细胞间的紧密连接遭到破坏,肠绒毛的高度降低,由于肠系膜血管收缩导致肠系膜血管血流量减少,严重者甚至出现黏膜溃疡、坏死，导致肠屏障功能丧失。屏障功能丧失导致肠道菌群移位和肠源性内毒素血症，这种感染对机体造成第二次打击(second attack)，引起的全身毒素吸收使肠黏膜的微循环遭到破坏，通透性增高，大量细菌移位，加重全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)，最终引发患者多器官障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，导致患者死亡。因而在SAP发生时积极保护肠黏膜、改善肠黏膜微循环对减轻感染、缓解病情、最终对减轻SAP综合症状、改善SAP治疗效果有重要意义，而在这方面的研究笔者还未发现有突破性进展。本研究应用己酮可可碱(pentoxifylline,PTX)对SAP大鼠进行干预，检测PTX对肠黏膜微循环的影响，了解PTX对缓解SAP的作用及机制，为SAP治疗措施的改进提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物SD雄性大鼠96只购于河北医科大学动物学部，体重(330±30)g，鼠龄约9周。动物在SPF环境下常规饲养：温度为(23±1)℃；湿度为40%～60%；光照时间早7∶00至晚7∶00；采用新鲜干燥灭菌饲料。96只SD大鼠随机分为假手术(SO)组、SAP组和PTX组，每组32只。每组按时间分为2、6、12、24 h组，每组8只。

1.2主要试剂及仪器牛黄胆酸钠购自包头化学制品厂，使用前以0.9%氯化钠注射液配至浓度为3%。PTX购自山东益健药业公司。鲎试剂购自湛江海洋生物制品公司。淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIP)试剂盒购自德国Lidman公司。WS-9B型微循环显微镜及视图像分析系统、WS恒温、恒湿灌流系统均为徐州光学仪器厂产品。COBAS MIRA 全自动生化分析仪为瑞士产品。

1.3大鼠模型制备

1.3.1SAP组：SAP模型参照本课题组前期动物造模方法制备SAP模型[5]，胰胆管内插管给予5%牛黄胆酸钠，观察胰腺出现水肿、出血、坏死等改变以确定造模成功。制模成功后给予颈静脉置管经颈静脉微量注药泵补液。

1.3.2SO组：开腹后仅翻动胰腺及其他腹腔器官，不做胰胆管内插管给药，其余各项操作及补液均同SAP组。

1.3.3PTX治疗组：制备SAP模型成功后关腹，用微量注药泵经颈静脉给予各组动物0.9%氯化钠注射液补液。PTX治疗组于术后0.5 h经颈静脉给予PTX3 mg/100 g，后按2 mg·100 g-1·h-1维持。

1.4微循环观察窗的制备取各时相SD大鼠模型，麻醉后取正中切口，找到盲肠近侧4～5 cm回肠，提出此段回肠，置于恒温、恒湿、灌流系统中，沿对系膜缘无血管区纵行剖开肠壁3 cm，暴露肠黏膜，0.9%氯化钠注射液冲净并置于观测窗上。在落射卤素灯光源照射下以布氏显微镜观察肠黏膜微循环变化，并进行分析。

1.5微循环指标检测方法(1)用微循环图像分析软件对微血管口径直接测量(μm)；(2)微循环图像分析软件采用光点同步法对微血管血流速度直接测定(μm/s)；(3)血液相关指标检测：采用鲎试剂法对大鼠血浆LPS的水平进行测定；瑞士COBAS MIRA 全自动生化分析仪对大鼠血清AMY、LIP进行测定。

1.6检测指标(1)记录3组各时相大鼠腹水量；(2)观察胰腺大体改变及病理变化，计算胰腺病理评分；(3)检测3组各时相大鼠观察毛细血管口径、血液流速；微血管出血变化。

2结果

2.13组腹水量变化情况SO组各时相腹腔内偶见少量清亮腹水，均无法计量；SAP组各时相腹腔内均有淡红色或暗红色混浊腹水(5～17 ml)，明显比SO组增多(P<0.05)。PTX组较SAP组各时相腹水量均有明显减少(P<0.05)。见表1。

表13组不同时相点腹水量比较

组别2h6h12h24hSO组0000SAP组5.16±1.30*9.07±1.55*12.68±2.00*15.46±2.02*PTX组3.86±1.00*#6.56±2.06*#8.85±1.71*#11.40±1.89*#

注：与SO组比较，*P<0.05；与SAP组比较，#P<0.05

2.23组胰腺变化

2.2.1胰腺大体变化：SO组各时相偶见胰腺轻度水肿，无其他明显改变；SAP组各时相可见胰腺不同程度水肿、充血、灰褐色坏死灶、胰周脂肪散在皂化，且随时间延长，出血、坏死程度加重；PTX组胰腺存在水肿、出血及坏死现象，但程度比SAP组轻微。

2.2.23组胰腺病理评分： SAP各时相病理评分明显高于SO组(P<0.05)。PTX组较SAP组各时相评分均有明显降低(P<0.05)。见表2。

2.33组微血管管径变化情况

2.3.1微动脉管径观察：SAP组、PTX组微动脉管径各时相点均小于SO组(P<0.05)，PTX组的微动脉管径明显小于SAP组(P<0.05)。见表3。

表2　3组不同时相胰腺病理评分比较　n=8,分,±s

注：与SO组比较，*P<0.05；与SAP组比较，#P<0.05

表33组不同时相微动脉管径比较

组别2h6h12h24hSO组12.2±1.512.1±1.711.8±1.412.2±1.5SAP组6.1±1.0*7.17±1.05*5.9±0.4*5.8±0.4*PTX组10.2±1.3*#10.0±1.2*#9.8±1.2*#9.4±1.3*#

注：与SO组比较，*P<0.05；与SAP组比较，#P<0.05

2.3.2微静脉管径观察：SAP组、PTX组微静脉管径各时相点均小于SO组(P<0.05)，PTX组的微静脉管径明显小于SAP组(P<0.05)。见表4。

表43组不同时相微静脉管径的情况

组别2h6h12h24hSO组22.8±2.323.0±2.323.2±2.822.8±2.4SAP组10.4±1.2*12.4±1.8*10.0±1.1*9.3±1.0*PTX组17.5±1.8*#17.8±2.0*#17.4±2.1*#18.4±2.0*#

注：与SO组比较，*P<0.05；与SAP组比较，#P<0.05

2.43组微血管血流速度变化情况

2.4.1微动脉血流速度测定结果：SAP组、PTX组微动脉血流速度各时相点均比SO组缓慢(P<0.05)，但PTX组的微动脉血流速度明显比SAP组缓慢(P<0.05)。见表5。

表53组不同时相微动脉血流速度比较

组别2h6h12h24hSO组303.0±42.6291.9±35.5309.5±33.1300.2±26.1SAP组109.5±16.8*129.7±19.0*93.7±9.7*89.7±10.4*PTX组219.5±31.6*#226.0±36.3*#223.4±31.5*#214.8±25.7*#

注：与SO组比较，*P<0.05；与SAP组比较，#P<0.05

2.4.2微静脉血流速测定结果：AP组、PTX组微静脉血流速度各时相点均比SO组缓慢(P<0.05)，但PTX组的微静脉血流速度明显比SAP组缓慢(P<0.05)。见表6。

表63组不同时相微静脉血流速度比较

组别2h6h12h24hSO组274.2±28.7268.0±28.5270.8±25.7272.6±25.0SAP组99.0±12.7*113.6±13.0*98.5±12.7*84.6±10.6*PTX组211.1±27.1*#218.4±24.7*#215.3±28.4*#207.0±28.9*#

注：与SO组比较，*P<0.05；与SAP组比较，#P<0.05

2.53组血液相关指标比较SAP组各时相LPS、AMY、LIP水平均明显高于SO组(P<0.05)，且随时间延长LPS水平逐渐升高(P<0.05)；而SO组LPS、AMY、LIP各时相水平变化不明显(P>0.05)。PTX组LPS、AMY、LIP水平明显低于同时点SAP组，但仍高于SO组(P<0.05)。见表7～9。

3讨论

经多年研究，药物(如生长抑素类)及综合治疗不断进步，目前轻症胰腺炎的死亡风险已大大降低，预后良好。另有少数重者的胰腺出血坏死，常继发感染、腹膜炎和休克等，病死率高，称为SAP。这些患者仍然预后较差，即使经过积极治疗，SAP的病死率仍高达20%～50%，对健康危害极大[5]。SAP虽原发病灶在胰腺，但其损伤是全身性的[6]。胰腺外器官损伤包括肺、肝、心脏、肾脏、肠道的损伤，这些脏器的损伤及功能障碍往往造成严重后果，甚至导致患者死亡。因此，在当前胰腺炎的研究中，减轻胰腺外器官损伤已成为胰腺炎综合治疗的重要内容。如能有效控制SAP时的胰腺外脏器损伤，可明显缓解病情，减低病死率，改善治疗效果。在SAP胰腺外器官损伤中，肠黏膜损伤有独特的特点。但SAP发生时，肠黏膜的微循环在全身炎性反应的影响下出现障碍，导致肠黏膜屏障功能丧失，肠道细菌发生移位，使炎性反应进一步加重，最终导致MODS，患者死亡[7,8]。在急性胰腺炎尤其是SAP发生后，由于全身的炎性反应，引起全身血管通透性增加，导致大量液体到达第三间隙，引起血容量降低，引起肠道及其他内脏血管收缩，导致肠道血液供应减少。同时在SAP发生时，机体处于应激状态，无氧代谢增加，酸性代谢产物积聚，引起细胞内酸中毒，肠黏膜上皮细胞水肿、脱落、通透性增加，随后随着机体自身代偿及实施相关治疗措施后肠道血流的恢复，缺血再灌注通过白细胞的呼吸爆发、线粒体的细胞色素氧化酶功能异常等多种途径生成大量氧自由基(OFR)。OFR可破坏 DNA，并促进中性粒细胞的黏附，引起肠黏膜更进一步的损伤。另外，多种炎性介质与细胞因子包括磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)、一氧化氮(nitricoxide NO)、内皮素(endotllelin，ET)、血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)等在肠屏障损害中发挥了重要作用。这些因子通过激活T细胞、B细胞，调节机体的免疫反应，刺激造血干细胞的增殖，使急性期反应蛋白合成及分泌增加、增强炎性反应的强度，损伤肠黏膜细胞，破坏肠黏膜屏障。但SAP发生时，患者由于长时间禁食、胃肠减压等措施导致营养摄入不充分，加上此时机体处于应激、高代谢状态，促使谷氨酰胺(glutamnie，Gln)、精氨酸的减少，导致巨噬细胞、淋巴细胞功能调节障碍。本研究发现，SAP大鼠的肠黏膜微血管在短时间内即发生明显收缩，血流速度呈现先加速、后减速的趋势，最终发生微血管出血，微循环障碍形成。这种微循环的障碍与腹水量增加有关，并可使胰腺病理状态进一步恶化。本研究结果与牛天平等[9]的研究相符合。证实本研究成功建立了SAP模型并发生率肠屏障损害。这些结果提示采取措施改善SAP时肠道的微循环状态对于肠黏膜局部功能及整体病情均有重要意义。

表73组不同时相血浆LPS水平

组别2h6h12h24hSO组48.8±3.448.4±4.947.4±4.747.5±4.0SAP组78.6±6.3*181.0±13.6*289.2±22.2*323.6±27.6*PTX组69.7±5.1*#118.57±12.1*#155.95±9.7*#202.1±18.6*#

注：与SO组比较，*P<0.05；与SAP组比较，#P<0.05

表83组不同时相血清AMY水平

组别2h6h12h24hSO组1133±1651190±1381119±1521164±178SAP组9631±865*16767±1404*16414±1467*15789±1080*PTX组5963±506*#7484±524*#8787±667*#7908±733*#

注：与SO组比较，*P<0.05；与SAP组比较，#P<0.05

表93组不同时相血清LIP水平

组别2h6h12h24hSO组324±34318±27309±27319±27SAP组5732±366*7404±507*7091±702*6796±522*PTX组3077±357*#3571±257*#4444±398*#4647±449*#

注：与SO组比较，*P<0.05；与SAP组比较，#P<0.05

PTX全称为3，7-二氢-3，7-二甲基-1-(5-氧代己基)-1H-嘌呤-2，6-二酮，属于甲基黄嘌呤衍生物，可以阻断环磷酸腺苷(cAMP)转变为AMP。PTX具有明显的扩血管、抑制血小板聚集的作用，还能够通过抑制免疫细胞活性、抑制炎性介质、阻断细胞钙内流、清除氧自由基等作用而减轻炎性反应、缓解机体的应激状态[10,11]。邵洪波等[12]研究发现将PTX给予化学烧伤患者静脉滴注，结果发现PTX可以有效改善创面的微循环，对化学烧伤有明显减轻作用。关于PTX的作用机制，徐家丽等[13]研究发现PTX可通过调节肿瘤坏死因子-α(TNF-α)而影响VEGF表达，从而干预血管内皮细胞形成。PTX的这种作用可能也是其在肠黏膜中的作用机制。张庆富等[14]对高压电烧伤大鼠进行研究，发现高压电烧伤大鼠血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)含量增高，引起微血管收缩；PTX可通过抑制Ang-Ⅱ表达而使肠系膜微血管舒张。这些研究为PTX的作用机制做出了一定的阐述。但目前关于PTX对于SAP时肠黏膜的作用还不清楚。本研究发现，PTX可以有效改善肠黏膜微循环状态、减轻出血再灌注损伤，对肠黏膜屏障具有明显的保护作用。进一步研究发现，PTX还可以明显降低血液中LPS、AMY、LIP水平，这一作用对于缓解SAP的全身炎性反应有重要意义。

SAP虽原发于胰腺，但其造成的损害是全身性的，多种脏器在SAP时发生功能障碍。纠正休克，改善器官微循环及缺血再灌注损伤。对于SAP并发休克患者应积极补充血容量，改善微循环障碍，因此液体及药物治疗改善SAP患者的微循环状态成为了在SAP综合治疗中不可忽视的核心治疗环节之一。多种药物对SAP微循环的改善效果并不令人满意。本研究在新药物改善SAP肠道微循环障碍方面开展了工作。结果发现PTX对于SAP时肠黏膜微循环有明显的改善作用，是值得进一步研究并进行临床推广的药物。其他研究者的相关研究报道很少，因此本研究具有较好的创新性。加之PTX毒副作用较小，具有很好的临床推广前景。但本研究只进行了大鼠动物实验，具体的作用机制还不明确，且该药物用于临床对SAP患者肠黏膜作用如何也未涉及。这些内容在进一步的研究工作中应深入探讨，同时在条件成熟时进行临床应用，为SAP综合治疗水平的提高做出贡献。

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12邵洪波,刘成奇,姚月明.己酮可可碱对化学烧伤创面局部微循环变化的干预作用.河北医药,2015,37：528-529.

13徐家丽,冯丹.己酮可可碱对子宫内膜异位症大鼠血管内皮生长因子表达的影响.数理医药学杂志,2013,26：275-277.

14张庆富,周慧敏,梁利民,等.高压电烧伤对大鼠血清血管紧张素Ⅱ和微血管功能的影响及己酮可可碱的干预作用.中华损伤与修复杂志(电子版),2012,7：228-232.

Experimental study of the effects of pentoxifylline on microcirculation of intestinal mucosa in rats with severe acute panreatitis

WANGDong,LIYong,XUBaoli,etal.

DepartmentofGeneralSurgery,TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,HebeiShijiazhuang050011,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects and significance of pentoxifylline (PTX) on microcirculation of intestinal mucosa in rats with severe acute panreatitis (SAP).MethodsA total of 96 SD rats were randomly divided into 3 groups: shame-operation (SO) group,SAP model group,PTX treatment group.After the animal models with SAP were established, the ascites amount, pancreatic pathological changes, micrangium caliber and velocity of intestinal mucosa were observed at 2h,6h,12h,24h after operation, moreover,the levels of plasma LPS,serum AMY and LIP were detected for the three groups.ResultsThere were significant differences in ascites amount, pancreatic pathological scores at the four time points between SAP group and SO group as well as between PTX group and SAP group (P<0.05).As compared with those in SO group, micrangium caliber and velocity of intestinal mucosa were significantly decreased in SAP group and PTX group (P<0.05).The levels of LPS,AMY,LIP in SAP and PTX group were significantly higher than those in SO group (P<0.05).ConclusionPTX can effectively improve microcirculation of intestinal mucosa in rats with SAP.

【Key words】severe acute pancreatitis；intestinal injury；microcirculation；pentoxifylline；rats

(收稿日期：2015-09-04)

【中图分类号】R 576.1

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)06-0808-04

通讯作者：李勇，050011石家庄市，河北医科大学第四医院外三科；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.06.002

E-maill：li_yong_hbth@126.com