脑清通颗粒质量标准的研究*

严亚锋，白海侠，史亚军陕西中医药大学，陕西咸阳712046



脑清通颗粒质量标准的研究*

严亚锋，白海侠，史亚军
陕西中医药大学，陕西咸阳712046

［摘要］目的：建立脑清通颗粒的质量标准。方法：采用薄层色谱法(TLC)法鉴别方中决明子、川芎、山楂和水蛭，采用高效液相色谱法(HPLC)法测定赤芍中芍药苷的含量。结果：决明子、川芎、山楂和水蛭TLC色谱斑点清晰，无干扰，芍药苷在0.0216～0.1944mg/mL范围内线性关系良好（r=0.9997），平均加样回收率为99.19％，RSD=1.13％。结论：所建立的薄层鉴别方法斑点清晰、专属性强、重现性好，含量测定方法分离度好、结果准确，可有效控制脑清通颗粒的质量。

［关键词］脑清通颗粒；芍药苷；决明子；川芎；山楂；水蛭

Study on Quality Standard of NaoQingTong Granules

YAN Yafeng,BAI Haixia,SHI Yajun
Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046,China

AbstractObjective:To establish quality standard of NaoQingTong granules.Methods:JueMingZi (Semen Cassiae),ChuanXiong (Ligusticum chuanxiong Hort.),ShanZha(Crataegus pinnatifida Bunge)and ShuiZhi(Whitmania pigra Whitman) in the prescription were identified by TLC method,the contents of peoniflorin was determined in ChiShao by using HPLC method.Results:Chromatographic spots of JueMingZi,ChuanXiong,ShanZhan and ShuiZhi were clear,and the blank test showed no interference,peoniflorin demonstrated better linear relationship in the range between 0.021 6 and 0.194 4 mg/mL(r=0.9 99 7),average recovery rate was 99.19％,RSD=1.13％.Conclusion:The TLC method,showing clear spots,high specificity,reproducible,good separation and accurate,could be used for quality control of NaoQingTong granules.

Keywords NaoQingTong granules;peoniflorin;JueMingZi;ChuanXiong;ShanZha;ShuiZhi

脑清通颗粒是首届国医大师，著名中医内科专家，博士、硕士研究生导师，中华中医药学会常务理事，国家中医药管理局中医急症、脑病协作组组长，陕西省首届名老中医，陕西中医学院名誉院长、终身教授，陕西中医学院原院长张学文教授数十年治疗眩晕(高血压)、中风等表现为肝热痰瘀证等疾病的临床经验方，由决明子、丹参、姜半夏、野菊花、豨签草、川芎、赤芍、水蛭、生山楂等中药组成，具有清肝活血、涤痰通络之功效，多用于眩晕、头痛、中风先兆、中风等肝热痰瘀证疾病。笔者对方中决明子、川芎、山楂和水蛭采用薄层色谱(TLC)法进行了鉴别研究［1-2］，对赤芍所含芍药苷采用高效液相色谱法(HPLC)进行含量测定研究［1，3-4］，该薄层鉴别方法和含量测定方法简便、准确、专属性强、重复性好，可有效控制脑清通颗粒的产品质量。

1　仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱仪(Angilent Technologies)、Angilent C18色谱柱、十万分之一电子天平(梅特勒)、超声波清洗机(深圳和科达超声仪器有限公司提供)、DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司提供)、电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司提供)、三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司提供，WFH-201B紫外投射反射仪)、双槽层析缸(规格200 mm×200 mm)。

1.2试药芍药苷对照品(批号：110736-201136)；山楂对照药材(批号：121137-201003)、水蛭对照药材(批号：12106-200503)、川芎对照药材(批号：110736-200424)、赤芍对照药材(批号：121092-200402)、决明子对照药材(批号：121544-201007)、大黄酚对照品(批号：110796 -200514)，均由中国药品生物制品检定所提供；乙腈为色谱纯、磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司生产)、娃哈哈纯净水。其他试剂均为分析纯，购自西安化学试剂厂；脑清通颗粒由陕西中医学院附属医院制剂中心制备(批号：130501、130502、130503)。

2　方法与结果

2.1薄层色谱鉴别

2.1.1决明子称取本品3 g，加甲醇25 mL，浸渍1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水25 mL使溶解，加盐酸2 mL，水浴加热回流30分钟，放冷，用乙醚萃取2次，25 mL/次，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取阴性样品(缺决明子)3 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。再取决明子对照药材1 g，加甲醇20 mL，同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。再取大黄酚对照品，用无水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)溶液配制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-丙酮(2∶1)的溶液为展开剂，展开，取出，自然晾干。供试品色谱中，分别在与对照药材和对照品色谱相应位置上，显相同颜色的黄色斑点，阴性对照在与对照药材和对照品色谱相应的位置上无干扰。见图1。

图1　决明子的TLC图谱

2.1.2川芎称取本品6 g，加乙醚50 mL，置水浴上回流1小时，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液。另取阴性样品(缺川芎)6 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。再取川芎对照药材1 g，加乙醚25 mL，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)溶液为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的亮蓝色荧光斑点，阴性对照在与对照药材色谱相应的位置上无干扰。见图2。

图2　川芎的TLC图谱

2.1.3山楂称取本品4 g，加乙醇25mL，置水浴加热回流20分钟，滤过，滤液水浴蒸干，加20 mL水使溶解(加热)，以水饱和的正丁醇15 mL提取，分层后取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取阴性样品(缺山楂)4 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。再取山楂对照药材1 g，加乙醇20 mL，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮(9∶1)溶液为展开剂，展开，取出，晾干。喷10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的暗红色斑点，阴性对照在与对照药材色谱相应的位置上无干扰。见图3。

图3　山楂的TLC图谱

2.1.4水蛭取本品20 g，加乙醇50 mL，超声15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取阴性样品(缺水蛭)20 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。再取水蛭对照药材1 g，加乙醇10 mL，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(4∶1)溶液作为展开剂，展开，取出，晾干。喷10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫色斑点，阴性对照在与对照药材色谱相应的位置上无干扰。见图5。

图4　水蛭的TLC图谱

2.2芍药苷含量测定

2.2.1色谱条件色谱柱：Angilent C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：乙腈-0.1％磷酸溶液(14∶86)；检测波长：230 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；理论板数按芍药苷计算应不低于2 000。

2.2.2供试品溶液的制备取本品适量，研细，取2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理30分钟，放冷，再称定质量量，用甲醇补足损失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3对照品溶液的配制精密称取芍药苷对照品5.40 mg，加甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，摇匀，取2 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.2.4标准曲线和线性范围考察精密称取芍药苷对照品10.80 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液待用。精密吸取储备液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，在“2.2.1”色谱条件下测峰面积。以峰面积对芍药苷浓度进行线性回归，得线性方程为：Y=981.27X-24.55，r=0.999 7。结果表明：芍药苷在0.021 6～0.194 4 mg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5干扰实验照处方比例制备缺赤芍的阴性样品，取2.0 g，按供试品溶液制备方法制备成阴性对照溶液。精密吸取阴性对照溶液、对照品溶液及供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件测定，结果阴性对照在芍药苷峰部位无干扰。见图5。

图5　脑清通颗粒HPLC色谱图

2.2.6精密度实验精密吸取同一份供试品(批号：130501)溶液10 μL，重复进样6次，测定峰面积积分值，芍药苷含量的RSD=1.04％(n=6)。结果表明，本法精密度良好。

2.2.7稳定性实验取同一批号的供试品(批号：130501)溶液，分别于0、2、4、6、8小时精密吸取10 μL，按上述色谱条件测定峰面积积分值，芍药苷含量的RSD=2.20％(n=5)，表明在8小时内稳定性良好。

2.2.8重复性实验取同一批号供试品(批号：130501)6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定芍药苷峰面积积分值，并计算得平均含量为2.24 mg/g，其含量的RSD=1.96％(n=6)。

2.2.9加样回收率实验称取批号为130501 (2.24 mg/g)的样品6份，每份约1 g，精密称定，分别精密加入芍药苷对照品适量，按“2.2.2”项下方法制得供试品溶液，并按“2.2.1”色谱条件测定峰面积，计算回收率，结果平均回收率为99.19％，RSD=1.13％(n=6)。见表1。

表1　加样回收率试验结果(n=6)

2.2.10样品含量测定取3批样品，依“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，并按上述色谱条件测定，结果如下：批号：130501，含量2.24 mg/g，批号：130502，含量2.17 mg/g，批号：130503，含量2.11 mg/g。

3　讨论

本实验曾对姜半夏、丹参、野菊花、豨莶草、石菖蒲等药材也进行了薄层色谱鉴别，但由于干扰明显、重复性差等，结果均不理想，有待进一步研究。含量测定研究中供试品溶液制备方法曾比较了超声提取和回流提取，结果发现两者提取效果无明显差异，考虑超声提取简单、省时，因此选择超声提取。对超声时间也进行了考察，发现30分钟即可将芍药苷提取完全。考察了甲醇-0.05 mol/L磷酸二轻钾溶液、乙腈-0.1％磷酸溶液等流动相，并进行了多种比例的调整，结果以乙腈-0.1％磷酸溶液(14∶86)比例分离度、重复性等均较理想，因此确定此流动相。根据3批样品测定结果，考虑到药材产地及每批次有效成分含量存在差异，因此暂定本品每袋含赤芍以芍药苷(C23H28O11)计，不得少于1.50 mg。

参考文献

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京:中国医药科技出版社，2010：1217.

［2］吕武青.中成药中药材薄层色谱鉴别［M］.北京：人民卫生出版社，1997：3.

［3］徐德铸，朱艳华，郭惠琴.HPLC法测定妇康胶囊中芍药苷的含量［J］.陕西中医，2003，24(10)：937-939.

［4］张静，杨俊，李娟.HPLC法测定消乳散结胶囊中芍药苷的含量［J］.中医药导报，2011，17(2):73-74.

作者简介：严亚锋(1976—)，男，硕士学位，讲师，工程师，执业药师。研究方向：老年病的中药防治。

*基金项目：陕西省教育厅自然科学基金项目(编号2013JK0831，14JK1195)。

收稿日期：2015-02-27

［中图分类号］R283

［文献标识码］A

［文章编号］1004-6852(2016)02-0023-04