草莓茎尖组织培养防褐化技术优化研究

付崇毅，姜 伟，郝利清，王建国，杜金伟

（1.内蒙古农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031；2.内蒙古商都县林业工作站，内蒙古商都 013450）

近年来随着草莓组培脱毒苗的推广普及，草莓组培脱毒苗需求量不断增加，茎尖组织培养是目前生产上获得草莓脱毒苗的主要途径之一。在草莓组织培养中褐化是最常见的问题[1]，其与菌类污染、玻璃化并称为组织培养的三大难题，褐化严重影响了草莓茎尖生长和分化。本试验在总结前期对草莓组培褐化问题研究基础上，进一步研究并优化了草莓茎尖组织培养防褐化技术，以期为内蒙古自治区草莓组培脱毒苗规模化快速培育种苗提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料及地点

选取生长健壮的“红颜”草莓母株上新长出的匍匐茎顶端3～4 cm长的顶芽为试验材料。试验于2015年3月—2015年5月在内蒙古农牧业科学院蔬菜研究所试验场日光温室及实验室内进行。

1.2 试验处理

试验Ⅰ：VC溶液的不同浓度浸泡处理对草莓茎尖褐化影响研究。2015年3月，取试验材料经灭菌后，采用不同浓度VC溶液进行浸泡处理，浸泡时间10 min（表1）。然后在超净工作台上剥去幼叶，由顶芽分生组织上切取0.3～0.4mm茎尖，接种于装有诱导培养基的三角瓶（50 mL）内进行培养，每瓶接种4个茎尖。每个处理接种10瓶，3次重复。培养条件为光照 1 500～2 000 Lx，12 h/d，温度 16～22 ℃。

表1 不同VC溶液浓度对草莓茎尖褐化影响试验处理

试验Ⅱ：VC溶液不同浸泡时间对草莓茎尖褐化影响研究。2015年4月，取试验材料经灭菌后，采用300 mg/L VC溶液进行不同时间的浸泡处理（表2）。然后在超净工作台上剥去幼叶，由顶芽分生组织上切取0.3～0.4mm茎尖，接种于装有诱导培养基的三角瓶（50 mL）内进行培养，每瓶接种4个茎尖。每个处理接种10瓶，3次重复。培养条件为光照1 500～2 000 Lx，12 h/d，温度 16～22 ℃。

表2 VC溶液不同浸泡时间对草莓茎尖褐化影响试验

试验Ⅲ：抗氧化剂和吸附剂对草莓茎尖褐化影响研究。2015年5月，取试验材料经灭菌后，采用300 mg/L VC溶液浸泡12 min（表3）。然后在超净工作台上剥去幼叶，由顶芽分生组织上切取0.3～0.4mm茎尖，接种于装有诱导培养基的三角瓶（50 mL）内进行培养，诱导培养基中分别添加有PVP（抗氧化剂）或活性炭（吸附剂）。每瓶接种4个茎尖。每个处理接种10瓶，3次重复。培养条件为光照1 500～2 000 Lx，12 h/d，温度 16～22 ℃。

表3 不同防褐化措施对草莓茎尖褐化影响试验

1.3 测定指标和方法

各处理在茎尖接种14 d后统计褐化率和萌发率。褐化：接种后的茎尖表面全部变为褐色即认为该茎尖出现褐化。萌发：接种后的茎尖出现膨大的愈伤组织即认为该茎尖被诱导萌发。

褐化率和萌发率分别按以下公式计算：

1.4 数据分析

试验数据采用Excel 2007进行处理，SAS9.0软件进行统计分析。利用隶属函数法对各试验处理效果进行综合评价。

式中Xi为指标测定值的平均值，Xmax、Xmin为所有处理某一指标平均值的最大值和最小值。各处理各指标数值转换后进行累加，取其平均值以评价各处理的防褐化或玻璃化效果。

2 结果与分析

2.1 不同VC溶液浓度浸泡处理对草莓茎尖褐化影响

由表4可知，N3萌发率最高，且与CK间差异显著（P＜0.05），N1、N2、N4、N5 之间差异不显著。N3褐化率最低，其次是N4，两者与CK间均差异显著（P＜0.05），N1、N2、N5与 CK 间差异不显著。采用隶属函数分析后可知，N3的萌发率和褐化率隶属函数均为1，且综合评价值最高。

表4 不同VC溶液浓度浸泡处理对草莓茎尖褐化影响比较

2.2 VC溶液不同浸泡时间对草莓茎尖褐化影响

由表5可以看出，VC浸泡处理的草莓茎尖萌发率显著（P＜0.05）高于CK，P5萌发率最高。P4褐变率最低，其次为P5，P4与P5间差异不显著。P3、P4、P5与对照间差异显著。利用隶属函数通过计算综合分析可知，P4综合评价值最高。

表5 VC溶液不同浸泡时间对草莓茎尖褐化影响比较

2.3 抗氧化剂和吸附剂对草莓茎尖褐化影响

由表6可知，Z1萌发率最高，且褐变率最低，与CK间差异显著（P＜0.05）。Z2处理能降低褐变率，使萌发率升高，但与CK间差异不显著。进一步利用隶属函数通过计算综合分析后发现，Z1综合评价值最高。

表6 不同防褐化措施对草莓茎尖褐化影响比较

3 讨论

相关研究表明[2-3]，褐化的主要原因是酚类物质在多酚氧化酶作用下被氧化形成醌而引起的，在组织培养中加入抗氧化剂或吸附剂[4-8]可预防醌类物质形成[9]，同时VC作为一种抗褐化剂也广泛应用在植物组织培养中[10-11]。采用过滤灭菌方法把VC加入培养基中，虽可以显著降低草莓茎尖褐化率，但操作费时费工。而利用VC溶液对草莓匍匐茎顶芽进行浸泡预处理，操作更为简单。本试验研究发现，当VC溶液浓度为300 mg/L时，可显著降低草莓茎尖褐变率，并促进茎尖愈伤组织萌发，显著提高萌发率。当VC浸泡时间达到9 min后，草莓茎尖褐变率比对照才显著降低，说明采用VC溶液浸泡预处理草莓顶芽，必须达到一定的时间才能抑制草莓茎尖的褐化。此外，在培养基中添加抗氧化剂PVP可显著降低草莓茎尖褐化率，同时也能促进愈伤组织的萌发，萌发率可达到100%。而添加吸附剂活性炭对抑制草莓茎尖褐化的发生作用不明显。综上所述，通过采用VC溶液浸泡预处理草莓顶芽，在培养基中添加抗氧化剂PVP，综合两种抗褐化措施可显著抑制草莓茎尖褐化的发生，并能促进草莓茎尖愈伤组织的萌发。

4 结论

采用VC溶液对草莓顶芽进行浸泡预处理，最适宜浓度为300 mg/L，最适宜浸泡时间为12 min。VC溶液浸泡预处理后在培养基中添加1.5 g/L PVP对草莓茎尖褐化的发生抑制效果最好，茎尖愈伤组织萌发率达到100%。

参考文献：

［1］袁云香.金属元素与植物组织培养［M］.杨凌：西北农林科技大学出版社，2013.

［2］姚洪军，罗晓芳，田砚亭.植物组织培养外植体褐变的研究进展［J］.北京林业大学学报，1999，21（3）：78-84.

［3］蒋益虹.百合褐变与多酚氧化酶和过氧化物酶活性关系的研究［J］.浙江大学学报，2003，29（5）：518-522.

［4］刘兰英.“薄壳香”核桃组培中的褐化及防止措施研究［J］.园艺学报，2002，29（2）：171-172.

［5］陈 友，冯慧敏.海南野生蕉吸芽组培防褐化研究［J］.热带农业工程，2012，36（6）：12-15.

［6］王照红，衣葵花，周象海，等.几种药物抑制剂桑树组培苗褐化的研究［J］.山东农业科学，2008，7：69-70.

［7］陈贝贝，汪安乐，蒋 明，等.黄精叶钩吻组培中褐化控制的探讨［J］.浙江农业科学，2012（4）：490-492.

［8］李 萍，成仿云，张颖星.防褐化剂对牡丹组培褐化发生、组培苗生长和增殖的作用［J］.北京林业大学学报，2008，30（2）：71-76.

［9］李新凤.牡丹胚离体植株再生及组培中褐化问题的研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2008.

［10］吕宗友，苏衍菁，赵国琦，等.不同防褐化措施对苏丹草愈伤诱导以及抗褐化的效果研究［J］.草业学报，2011，20（3）：174-181.

［11］邵菊芳，朱红威，于文峰，等.抗氧化剂和吸附剂促进银杏愈伤组织生长及防止褐化作用研究［J］.福建林业科技，2009，36（3）：117-120.