芸薹属作物远缘杂交子房离体培养的研究进展

贾思齐，王 超

（东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030）

芸薹属（Brassica）作物在世界范围内大约有100多种，其中我国有15种、11种变种和1个变型[1]，包括重要的蔬菜、油料、香料和药用植物，如青花菜、油菜、甘蓝、芥菜等，此属在十字花科作物中是最具有经济价值的一类，其在国内外受到了广大学者的青睐。远缘杂交是指在不同种、属以及更远亲缘关系之间的杂交，通过远缘杂交可以获得抗病虫害、高光和效率、抗寒、耐旱等优良特性，其在芸薹属作物育种中也得到了广泛的应用。但由于杂交障碍是远缘杂交的普遍现象，胚乳不能正常发育致使杂种胚得不到充足的养料而饿死，采用常规的人工杂交很难得到杂种种子。自Inomata首次报道采用子房培养技术获得了种间杂种以来，很多研究者相继采用子房离体培养技术成功获得了远缘杂交种子[2-4]。子房离体培养技术操作简单，可在短时间内提高杂交效率，加快育种进程，缩短育种年限，是芸薹属植物远缘杂交获得种子的重要手段。本文拟对芸薹属植物远缘杂交子房离体培养的影响因素、再生植株的杂种鉴定和染色体加倍等研究成果作如下的概述。

1 影响芸薹属杂种子房离体培养的因素

芸薹属植物远缘杂交杂种子房离体培养受供体植株的基因型、杂交组合、培养基和授粉后取材培养的最佳时间等因素的影响。

1.1 杂交植株的基因型

供体植株的基因型对远缘杂交子房离体培养的发生具有决定性的作用，供体亲本的不同基因型对作物产生的影响因作物不同而有显著差异[5]。王幼平等对海甘蓝与芸薹属属间杂交的亲和性研究发现，以海甘蓝为父本与同类型油菜中的不同基因型品种作母本进行杂交，其在受精亲和性上存在一定差异[6]。刘运霞等以小白菜雄性不育系为母本，花椰菜自交系为父本进行种间杂种离体子房培养，结果表明培养效果因父本花椰菜基因型的不同而不同[7]。周清元等利用不同基因型的羽衣甘蓝与白菜型油菜杂交可提高人工合成甘蓝型油菜的效率，通过子房离体培养表明其效率与父本的基因型有关[8]。Lu等在甘蓝与白菜的种间杂交得出了父本基因型对杂种率起着决定性作用[9]。在远缘杂交中父本作为供体，其基因型可能更多地决定着子房培养成功的机会。

1.2 杂交组合

王爱云等研究表明在以诸葛菜为父本的正交组合中，子房离体培养提高了获得杂交种子的频率。在以诸葛菜为母本的反交组合中，无论是子房离体培养还是田间培养，均没有获得饱满种子[10]。与此同时，Inomata的研究结果也表明子房离体培养能有效地提高白菜×甘蓝的正交组合杂种获得率，而对于甘蓝×白菜反交的组合培养效果甚微[2]。满红等通过4×菜薹与4×芥蓝种间杂交，借助于子房培养发现，以4×菜薹为母本授粉后的子房经离体培养均有存活的胚珠，而以芥蓝为母本时，无论培养授粉几天的子房，没有存活的胚珠[11]。M Leflon在以羽衣甘蓝为母本与白菜型油菜杂交，没有得到籽粒；但以白菜型油菜为母本与其羽衣甘蓝杂交时，通过子房培养后收获到了真正的杂种[12]。Müntzing认为种子的形成与母本、胚乳和胚这3种组织有关，三者在染色体数上必须是母本组织：胚乳：胚的比例为2∶3∶2，当上述三者的正常比例因倍数发生变化时，就会导致种间杂交败育情形[13]。Watkins又提出母本与胚乳的比例为2∶3时，即采用染色体数目高的一方作为母本远缘杂交可使种子正常发育[14]。

1.3 培养基

培养基是影响芸薹属远缘杂交子房离体培养的重要因素，在一些作物子房离体培养的过程中，选择合适的培养基类型、植物激素的种类、水平和配比及碳源的种类和浓度等诸多因素，是决定其培养成功与否的关键[15-17]。

Inomata等研究小白菜与羽衣甘蓝种间杂种子房离体培养时，发现在 MS、B5、White、Heller 和Nitsch 5种培养基中，MS培养的基培养效果最好[18]。但梁红等利用白菜与甘蓝的种间杂时，表明在White培养基上杂交子房培养获得良好的效果[19]。唐征等以甘蓝型油菜与青花菜种间杂种子房离体培养试验，通过MS培养基与White培养基相比，MS培养基更适合其培养。而在进行白菜型油菜和诸葛菜的杂交子房培养时也得到了同样的结果，MS培养基优于B5培养基，其对于杂交子房离体培养效果较好[20]。

何丹等通过对红菜薹与甘蓝型油菜的离体子房培养结果表明，采用MS+（1.0～2.0）mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+0.5%活性炭+30 g/L蔗糖+7.5 g/L琼脂培养基对其杂交子房培养效果较为理想；相对于培养基和激素，活性炭对子房培养的影响更加显著[21]。祝朋芳等研究表明，外源激素及其配比对子房离体结实具有极显著影响，以BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L最佳，结籽率为9%；其次为BA2 mg/L+NAA0.2 mg/L，结籽率为3%；BA2 mg/L+NAA 0.3 mg/L及无激素MS培养基上均未获得饱满种子[22]。张国庆等通过子房培养的方法获得白菜型油菜与甘蓝杂交再生苗发现，在MS基本培养基上添加1.0 mg/L的BA和0.1 mg/L的NAA对再生苗生根效果最好[23]。殷家明等对白菜型油菜×羽衣甘蓝子房培养研究表明，MS基本培养基添加0.2 mg/L NAA，1.0或2.0 mg/L BA和7%蔗糖时对其结籽促有进作用，结籽率较高；而在B5基本培养基上添加相同的激素则有抑制结籽作用[24]。因此，为了提高子房离体培养的成功效率，应针对每一个杂交组合的特性选择相应的培养基。

1.4 授粉后取材培养的最佳时间

授粉后子房取材培养最佳时间的选择决定其子房的存活率。Wen等利用小白菜和花椰菜杂交子房离体培养发现授粉第7 d的效果最好[25]。王爱云等对白菜型油菜与诸葛菜远缘杂交中发现自然条件下没有获得种子，但取授粉后第7 d的子房进行培养，其存活率和结籽率较高[10]。张国庆等发现在白菜型油菜和甘蓝杂交子房离体培养时，取授粉后第9 d的子房培养获得的种子最多，结籽率最高[26]。祝朋芳等以大白菜与羽衣甘蓝CMS种间杂种G3与羽衣甘蓝回交研究表明，授粉后9 d的子房培养效果最佳[22]。巩振辉等通过白菜与白芥进行属间杂种子房培养技术研究，结果表明授粉后6～8 d的杂种子房离体培养最好，获得的杂种种子最多，种子发芽率也最高[27]。张小玲等在甘蓝型油菜与花椰菜子房离体培养的研究中，得出培养授粉后12 d的杂种子房效果最好[28]。何丹等通过甘蓝型油菜和红菜薹杂交发现授粉后15 d为子房对杂交子房培养结籽率和杂种萌发率最高[21]。唐征等利用甘蓝型油菜与青花菜种间杂种子房离体培养研究结果表明：授粉后15 d的子房培养效果最好[20]。周清元等用不同基因型的羽衣甘蓝和白菜杂交进行子房培养发现授粉后15 d左右效果较理想[8]。因杂交组合的不同会直接影响子房培养取材时期的差异，因此，过早或过晚培养授粉后的离体子房都不利于杂种种苗的获得。

2 真假杂种的鉴定

2.1 形态学鉴定法

于海龙等通过芥蓝与甘蓝型油菜种间杂交经形态学观察F1单株形态特征总体介于两亲本之间，植株营养生长旺盛，呈现超亲优势[29]。赵志刚等利用常规杂交子房离体培养获得的杂种F1代植株，形态上表现为中间类型[30]。郭晓芹等在进行大白菜与花椰菜杂交时发现，异源四倍体和三倍体的株幅、株高、叶片长等性状较双亲有很大差别，而且大多数表型性状大于双亲，表现出超亲优势[31]。乔海云等以菜薹-青花菜异源双二倍体为桥梁与菜薹杂交获得了异源三倍体，其形态特征介于菜薹与青花菜之间，生长较旺盛[32]。形态学鉴定在实际操作上简单易行，但主观性强较容易受到人为因素的影响，因此还需结合其他方法进行真实有效地鉴定。

2.2 细胞学鉴定法

赵志刚等通过细胞学方法，鉴定了青海大黄油菜与黑芥杂种子房离体培养获得的F1代植株的细胞染色体数为18条，染色体数是母本青海大黄油菜（2n=AA=20）和父本黑芥（2n=BB=16）的配子之和[30]。乔海云等通过细胞学验证了大白菜与紫甘蓝种间杂交获得的杂种是真实的[33]。江莹芬等用细胞学对埃塞俄比亚芥和白菜型油菜远缘杂交的F1的染色体观察表明，染色体数为27条为真杂种，染色体数为34条为假杂种[34]。郭晓芹等根据大白菜与结球甘蓝杂交子房压片方式，发现异源四倍体的不同植株细胞染色体均为2n=38，而异源三倍体植株的细胞染色体数均为2n=29，异源四倍体植株包含了母本的两个染色体组和父本的两个染色体组，异源三倍体则包含了母本的两个染色体组和父本的一个染色体组[35]。张国庆等对子房离体培养的再生植株根尖进行染色体压片观察，结果表明，鉴定的9株植株中的单倍体染色体数目均为19，即再生植株的染色体数是白菜型油菜与甘蓝染色体的总和[26]。细胞学可以真实有效地鉴定杂交种的真伪，但细胞学标记有限，易受人为因素的影响加之芸薹属作物的染色体数目多且染色体小，因此仅用细胞学观察鉴定具有一定难度。

2.3 分子鉴定法

于海龙利用SSR标记辅助技术对芥蓝与甘蓝型油菜的45株BC1植株进行鉴定，其中35株为真杂种，10株为假杂种[29]。郭晓芹等利用SPAP分子标记对亲本及多倍体进行鉴定发现，异源多倍体中可同时扩增出母本与父本的特异性条带，是大白菜与花椰菜的杂交种[35]。赵志刚等也利用SSR技术对7株F1杂种植株鉴定，结果表明杂交得到的F1杂种植株同时具有父、母本的特征带，为真杂种[30]。王爱云等用SSR引物S82294对白菜型油菜和诸葛菜杂交的25株子房离体培养的F1再生植株进行杂种真伪的鉴定，扩增结果表明，分别以母本澧临白菜和湖北白菜以及父本诸葛菜DNA为模板，引物S82294能够稳定、清晰的扩增出200 bp和230 bp的条带，而用25株F1再生植株DNA为模板，仅1株扩增出既有母本230 bp又有父本200 bp的双亲互补型条带，因此认为该再生植株为真杂种，其余24株为伪杂种，将其剔除[10]。分子标记法具有扩增稳定、检测容易、多态性好及通用性强等特点，可以在子房离体培养获得再生植株苗期进行真假杂种的鉴定，为其早期培养选择提供了一种真实可靠的检测方法。

3 再生植株的加倍

子房离体培养和染色体加倍已成为获得芸薹属新物种的重要途径，同时对远缘杂种的保存和利用具有非常重要的意义。芸薹属植物获得的再生植株加倍方法有人工加倍和自然加倍两种，为了获得优良的目的性状，一般采用秋水仙素处理实现人工加倍，Choudhary等将母本Raphaanus candatus与父本B.tournefortii杂交，利用秋水仙碱人工加倍获得了异源双二倍体Rapha-nofortii植株，其结实性和可育率随着世代的提高逐渐增强[36]。陈洪高等利用何庆萝卜与白花芥蓝杂交，用秋水仙素使F1幼苗染色体加倍获得了萝卜-芥蓝异源四倍体[37]。Paulmann等用萝卜和甘蓝属间杂种为实验材料，通过秋水仙素加倍手段获得异源四倍体，再以该异源四倍体为桥梁与甘蓝型油菜杂交，成功地将萝卜的细胞质雄性不育基因以及恢复基因转移到了甘蓝型油菜中[38]。孙龙涛以白菜和黑芥为材料，通过种间杂交和采用0.2%浓度的秋水仙素人工诱导染色体加倍得到了6株异源四倍体和3株非整倍体[39]。Li等利用甘蓝和甘蓝型油菜为材料杂交并加倍后获得的六倍体为桥梁，进而得到了新型甘蓝型油菜[40]。周清元等通过羽衣甘蓝和芥菜型油菜种间杂交获得三倍体再生植株，以100 mg/L秋水仙素处理子房离体培养获得六倍体新物种，该杂种植株花瓣大且颜色深，花药饱满生长势较强[41]。子房离体培养及其染色体加倍已成为获得新种质资源的重要途径，多倍体可作为桥梁与芸薹属杂交得到新物种，通过这种方式不仅避免杂交的不亲和性，还可以将不同基因组信息渗入到其他作物中去，大大拓宽了芸薹属植物的遗传基础。

4 存在的问题与展望

利用子房离体培养克服了远缘杂交受精后胚胎发生障碍，获得了芸薹属较远亲缘关系属、种间杂交的再生植株，为进一步选育出新的品种奠定基础，是改良现有芸薹属植物品种的重要手段。目前还有两个方面的研究值得深入：第一，杂交子房离体培养获得再生植株还受到亲本基因型和杂交组合的影响，关于远缘杂交可交配遗传机理方面的研究较少。第二，离体子房的早期发育对培养基要求十分严格，普通的MS培养基无法满足其生长需求，因而子房离体培养很难成功；而授粉后过于延长在母本上发育的天数，由于杂种核和卵细胞质的代谢或胚胎与胚乳发育的不协调增加，导致杂种胚缺乏营养而饿死，而关于胚胎发育生理学和细胞胚胎学机理等方面的研究也需要进一步的完善。目前子房离体培养的研究还处于初步阶段，随着以后大量的研究探索，结合远缘杂交不亲和性的机理，建立更加有效的属间、种间子房培养体系，提高芸薹属植物远缘杂交子房培养的成功率。

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