不同处理对牡丹叶柄离体培养时褐化的影响

张庆瑞,赵国栋

(1.河南林业职业学院，河南 洛阳 471002；2.洛阳国家牡丹园,河南 洛阳 471011)

1 引言

牡丹(PaeoniaSuffruticosa)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)小灌木，其花型硕大、色泽艳丽、雍容华贵，自古以来，深受人们的喜爱。牡丹除了采用传统的嫁接和分株方法进行繁殖外，近年来，组织培养技术也取得了不小的进展，但在牡丹组培过程中，外植体褐化现象严重，严重影响愈伤组织的诱导、继代增值培养及根系的诱导[1～4]。本研究以“洛阳红”牡丹的叶柄为外植体，通过添加不同的物质，探索防止组织培养过程中叶柄褐化的方法。

2 材料与试验方案

2.1 材料

本实验以“洛阳红”牡丹的叶柄为试验材料，进行试验。5月份采集，修剪后经过流水清洗，75%酒精和0.1%的升汞消毒后，切成1.5 cm的小段，从中间劈开后接种。除矿物元素浓度试验外，其余试验方案中，基本培养基均为1/2MS培养基，添加3%蔗糖、0.75%的琼脂。除pH值试验外，其余培养基pH值均为5.8。培养室温度控制在25 ℃，光照强度为1500～2000 Lux，光照时数每天10 h。

2.2 试验方案

2.2.1 不同浓度Na2SeO3对牡丹叶柄褐化的影响

在基本培养基内分别加入不同浓度的Na2SeO3(0，0.01 mmol/L，0.05 mmol/L，0.1 mmol/L，0.2 mmol/L)，研究分析Na2SeO3不同使用量对牡丹叶柄褐化的影响。每处理5瓶，每瓶接种9个叶柄。7 d后的观察结果。

2.2.2 不同pH值对牡丹叶柄褐化的影响

将基本培养基的pH值分别调成5.2、5.8、6.6、7.4、8.0，观察外植体叶柄的褐化情况。每处理5瓶，每瓶9个叶柄。7 d后的观察结果。

2.2.3 蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏对牡丹叶柄褐化的影响

在基本培养基内，分别加入蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏，观察不同生物试剂对牡丹叶柄褐化的影响。每处理5瓶，每瓶9个叶柄。7 d后的观察结果。

2.2.4 不同矿物元素浓度对牡丹叶柄褐化的影响

以YEB为基本培养基，分别添加MS培养基中的大量元素(除Ca)，1/2MS培养基中的大量元素(除Ca)，MS培养基中的Fe、Ca盐，一半含量MS培养基中的Fe、Ca盐，MS培养基中的微量元素，一半含量MS培养基中的微量元素。以YEB为对照，研究不同矿物元素浓度对牡丹叶柄褐化的影响。每处理5瓶，每瓶接种9个叶。7 d后的观察结果。

2.3 褐化程度的分级标准

将牡丹叶柄褐化程度分为6个等级，从重到轻依次为：5级，极严重褐化，整个外植体变为黑色；4级，严重褐化，整个外植体变为棕黑色；3级，中度褐化，外植体70%以上部分变色；2级，轻度褐化，外植体两端变色较轻；1级，轻微褐化，基本上没有褐化；0级，无褐化，没有褐化。

褐化率=褐化数量÷接种数量×100%，

综合褐化程度=(褐化等级×该等级的褐化数量+褐化等级×该等级的褐化数量……)÷褐化总数。

3 结果与分析

3.1 不同浓度Na2SeO3对牡丹叶柄褐化的影响

采用不同浓度Na2SeO3处理“洛阳红”牡丹叶柄，第3d开始出现褐化，7d后统计结果(表1)。

从表1可知，Na2SeO3的防褐化效果很不理想，牡丹叶柄褐化严重，几乎100%褐化，且随着Na2SeO3使用浓度的增加，综合褐化程度呈加重趋势。因此，Na2SeO3显然没有达到控制牡丹叶柄褐化的理想效果。

表1 不同浓度Na2SeO3对牡丹叶柄褐化的影响

3.2 不同pH值对牡丹叶柄褐化的影响

不同pH值对牡丹叶柄褐化的影响结果见表2。从表2可以看出，当pH=5.2时，褐化率最低，随着pH值的升高，褐化率升高，在pH=7.4时，褐化率达到了100%，但总体褐化程度降到最低。

表2 不同pH值对牡丹叶柄褐化的影响

3.3 蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏对牡丹叶柄褐化的影响

表3为蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏对牡丹叶柄褐化的影响结果。由表3可知，无论添加哪种生物试剂，控制褐化的效果都不理想，不仅出现了100%褐化，褐化程度亦非常严重，所以这三种生物试剂对抑制牡丹叶柄褐化作用不明显。

表3 生物试剂对牡丹叶柄褐化的影响

3.4 不同矿质元素对牡丹叶柄褐化的影响

由表4可以看出，无论添加MS培养基中的哪种成分，与对照相比，各处理的褐化均显著加重，褐化率也较高。添加1/2MS大量元素(无钙)、MS大量元素(无钙)、1/2的MS Ca盐Fe盐、MS的Ca盐Fe盐等组合褐化率均达到100%，褐化程度方面，添加Ca盐Fe盐的组合均显著高于添加大量元素的组合。添加MS微量元素(无铁)组合的荷花率为90.7%，褐化程度显著低于添加添加Ca盐Fe盐组合和添加大量元素的组合，显著高于添加1/2的MS微量元素(无铁)。

表4 不同矿质元素浓度对牡丹叶柄褐化的影响

4 结论与讨论

某些植物材料在组织培养过程中会产生水解型多酚，这类外植体在培养过程中其培养基的颜色会变深，原因是多酚类物质分泌到培养基中，之后被氧化为醌类物质，而这些多酚类物质和醌类物质会抑制多种酶的活性，使得外植体对营养物质的主动吸收和转化受到阻碍[5]。本实验预通过添加Na2SeO3、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏等影响酚类化合物与酶结合，从而避免醌类物质的出现，阻止褐化的产生。但试验结果表明：该4种药品并没有起到有效的控制褐化的效果，对该研究没有实际意义。

成功的经验表明，选择适当的外植体并建立最佳的培养条件是克服材料褐化的最主要手段[6]。在牡丹叶柄组织培养的防褐化研究中，综合考虑褐化率及总体褐化程度，在牡丹叶柄组培中，应选用pH=5.2的培养基。一般认为，无机盐成分为组织培养众多的因子中较为重要的因素[7]。基于对不同矿质元素浓度对牡丹叶柄褐化影响的研究，在确保矿质营养元素充足的情况下，降低矿质营养元素含量有利于控制褐化。