芪蓝颗粒最佳提取工艺研究

严　鑫， 石　氵恬, 陈哲杰, 傅超美

(1.成都中医药大学 药学院， 四川 成都　611137；

2.成都市动物疫病预防控制中心， 四川 成都　610041)



芪蓝颗粒最佳提取工艺研究

严鑫1， 石氵恬2, 陈哲杰1, 傅超美1

(1.成都中医药大学 药学院， 四川 成都611137；

2.成都市动物疫病预防控制中心， 四川 成都610041)

摘要：为了优选芪蓝颗粒的最佳提取工艺条件.以R′S-告依春、毛蕊异黄酮苷的含量和干膏收率为指标，采用L9(34)正交设计试验考察提取时间、加水量和提取次数对芪蓝颗粒提取工艺的影响.芪蓝颗粒的最佳提取工艺为，提取3次，每次8倍量水，提取2 h.结果表明，优选出的最佳提取工艺合理、稳定，适合工业化大生产.

关键词：芪蓝颗粒；R′S-告依春；正交试验

0引言

将中药用于防治动物疾病及提高生产性能有着悠久的历史，并已形成了一套完整的理论体系[1].芪蓝颗粒由黄芪、板蓝根两味中药组成，具有清热解毒功效，体现为抗炎、调节免疫等药理作用[2-3]，对猪繁殖与呼吸综合征病毒具有很好的防治效果[4].为建立科学合理的提取工艺，本实验采用正交试验法，以处方中黄芪指标成分毛蕊异黄酮苷和板蓝根指标成分R′S-告依春的含量及收膏率为指标，考察提取时间、加水量、提取次数对黄芪和板蓝根水提工艺的影响，从而优选出芪蓝颗粒的最佳提取工艺条件.

1仪器与试药

1.1仪器

实验所用仪器包括：Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；METTLER AE240型电子分析天平(十万分之一)，梅特勒—托利多仪器有限公司；202-2型干燥箱，上海市试验仪器总厂.

1.2试药

实验所用试药包括：R,S-告依春对照品(批号，141121)、毛蕊异黄酮苷对照品(批号，150326)购于成都普菲德生物技术有限公司；板蓝根饮片(批号1403003)、黄芪(批号，1401003)购自新荷花中药饮片股份有限公司，药材经检验符合《中国药典》2015年版有关规定.甲醇、乙腈(色谱纯)，购自美国Sigma-Aldrich公司；水为超纯水，其余试剂均为分析纯.

2方法与结果

2.1色谱条件

采用同一色谱条件同时测定R,S-告依春和毛蕊异黄酮苷，其色谱条件为：Diamonsil色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相A为磷酸水溶液(含1%磷酸)，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱；梯度程序为0～20 min：9% B，20～22 min：9%～20% B，22～55 min：20%～30% B；检测波长245 nm；体积流量1 mL/min，进样量10 μL；理论板数不低于3×103.

2.2对照品溶液的制备

2.2.1R,S-告依春对照品溶液制备.

取R,S-告依春对照品适量，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容，配成浓度为1.07×10-4g/mL的R,S-告依春对照品贮备液.

2.2.2毛蕊异黄酮苷对照品溶液制备.

取毛蕊异黄酮苷对照品适量， 精密称定， 置于10 mL容量瓶中， 加甲醇溶液溶解并定容， 配成浓度为5.16×10-4g/mL的毛蕊异黄酮苷对照品贮备液.

2.3供试品溶液的制备

称取黄芪药材70 g，板蓝根药材30 g，置圆底烧瓶中，按“2.4”项下正交试验设计的不同工艺条件制备9组溶液，浓缩至300 mL.分别精密吸取5 mL，以12 000 r/min离心15 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过，制得供试品溶液.

2.4正交试验设计

采用L9(34)正交设计表，根据预实验结果，以提取时间、加水量和提取次数为考察因素，以R,S-告依春和毛蕊异黄酮苷的含量及干膏收率为考察指标，因素水平表见表1.

表1　L9(34)正交试验设计因素水平表

2.5方法学考察

2.5.1线性关系考察.

分别精密吸取2、5、8、10、15 mL R,S-告依春对照品贮备液和2、4、6、8、10 mL毛蕊异黄酮苷对照品贮备液，置于25 mL容量瓶中，分别加甲醇溶液稀释至刻度，配成不同浓度对照品溶液，进样10 μL，在“2.1”项色谱条件下测定.分别以进样量为横坐标，峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程、r值及线性范围见表2.

表2　R,S-告依春和毛蕊异黄酮苷线性关系

2.5.2精密度实验.

分别取R,S-告依春和毛蕊异黄酮苷对照品溶液，分别重复进样6次，进样量10 μL，依各法测定，记录峰面积.测得R,S-告依春和毛蕊异黄酮苷的RSD分别为1.09%和0.66%，结果表明，仪器精密度良好.

2.5.3重复性实验.

按正交试验设计方法制备的5号样品溶液制备方法，平行制备5份供试品溶液，进样量10 μL，依各法测定，记录峰面积.测得R,S-告依春和毛蕊异黄酮苷的RSD分别为0.63%和0.94%，结果表明，各方法重复性均良好.

2.5.4稳定性实验.

取正交试验设计方法制备的5号样品溶液方法制备的供试品溶液，4 ℃下放置0、2、4、6、8、10 h，进样量10 μL，依各法测定，记录峰面积.测得R,S-告依春和毛蕊异黄酮苷的RSD分别为0.57%和0.63%，结果表明，样品溶液在配置后10 h内均稳定.

2.5.5加样回收率实验.

分别称取3份黄芪70 g、板蓝根30 g，分成3组，按已知量(药材含量)分别加入1.0倍R,S-告依春和毛蕊异黄酮苷对照品溶液，按正交试验设计的5号供试品的方法制备，依各法测定，计算R,S-告依春和毛蕊异黄酮苷的平均回收率分别为102.42%和99.47%，RSD分别为0.47%和1.924%.

2.6干膏收率测定

精密吸取按各正交试验设计制备的水提液25 mL，分别置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥至恒重，置于干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，计算干膏收率.

2.7样品定量测定

分别按照正交试验设计不同工艺条件制备的9组供试品溶液，进样量10 μL，依各法测定，记录峰面积，计算R,S-告依春和毛蕊异黄酮苷的含量及干膏收率，结果见表3、表4.

表3　L9(34)正交试验设计及结果

表4　方差分析表

注：F0.05(2，2)=19.00，F0.01(2,2)=99.00,*显著性.

2.8正交试验结果

以R,S-告依春和毛蕊异黄酮苷及干膏收率为化学指标Ya(加权综合分：Ya%=Y1/Y1,Max×15+Y2/Y2,Max×55+Y3/Y3,Max×30,其中Y1为每个试验号样品重复取样3次测得的R,S-告依春质量浓度的平均值，Y1,Max为9个样品中R,S-告依春质量浓度的最大值，Y2为每个试验号样品重复取样3次测得的毛蕊异黄酮苷质量浓度的平均值，Y2,Max为9个样品中毛蕊异黄酮苷质量浓度的最大值)进行L9(34)正交试验优选最佳工艺条件.由直观分析可得出，各因素对试验的影响的重要性依次为，C(提取次数)>A(提取时间)>B(加水量)；从方差分析结果得出，因素A(提取时间)和C(提取次数)P<0.05，具有显著性.由正交试验设计的极差分析结果得到的最佳制备工艺为A2B2C3，即每次提取2 h，加8倍量水，共提取3次.

2.9验证实验

称取3份处方按照确定的优选工艺条件进行验证实验，结果见表5，结果表明该工艺稳定可行.

表5　验证实验结果

3讨论

板蓝根药材在《中国药典》2015版一部中采用高效液相色谱法测定板蓝根R′S-告依春的含量[5]，选定甲醇—0.02%磷酸溶液(7∶93)为流动相，芪蓝颗粒为中药复方制剂，成分多样，对R′S-告依春含量测定干扰大，该色谱条件下色谱峰出峰速率较慢.对此，在参考相关文献[6-7]基础上，本研究以乙腈—磷酸水溶液为溶剂系统,经过多次色谱条件优化实验发现，当以乙腈—0.1%磷酸水溶液(9∶91)为流动相时，R′S-告依春色谱峰达到基线分离，峰形对称度高，系统适应性实验符合要求，适用于芪蓝颗粒的定量分析.早期研究中发现，无论板蓝根在体内还是体外均有明显抗流感病毒活性[8]，R,S-告依春作为板蓝根抗病毒的有效成分之一[9]，故本研究选择R,S-告依春和处方中君药黄芪的有效成分毛蕊异黄酮苷的含量作为考察指标，通过正交试验设计，筛选最佳提取工艺.验证实验结果证明，优选出的最佳提取工艺稳定，适合于工业化大生产.

参考文献：

[1]张克家.21世纪兽医中药发展的思考[J].中国兽医杂志，2000，26(12):3-4.

[2]何立巍，李祥，陈建伟.板蓝根抗病毒有效成分研究进展[J].中医药信息，2005，22(5):37-40.

[3]张蔷，高文远，满淑丽.黄芪中有效成分药理活性的研究进展[J].中国中药杂志，2012，21(37):3203-3207.

[4]胡梅，崔保安，张红英，等.板蓝根、黄芪等中药活性提取物对猪繁殖与呼吸综合征病毒体外作用的研究[J].中兽医医药杂志，2006，25(6):14-17.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2015.

[6]张叶，张蕾，王玉.RP-HPLC法测定板蓝根药材中腺苷和表告依春的含量[J].药物分析杂志，2008，28(11):1848-1850.

[7]安益强，杨海英，杨琪伟，等.HPLC测定板蓝根药材及其制剂中表告依春的含量[J].中草药，2010，41(3):478-480.

[8]王学斌，魏战勇，崔保安，等.黄芪、板蓝根对猪细小病毒体外抑制作用研究[J].中国预防兽医学报，2006，28(6):715-719.

[9]徐丽华，黄芳，陈婷，等.板蓝根中的抗病毒活性成分[J].中国天然药物，2005，3(6):359-361.

Extraction Process of Chinese Veterinary Medicine Qilan Granules by Orthogonal Experiment

YANXin1,SHITian2,CHENZhejie1,FUChaomei1

(1.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137,China;2.Animal Diseases Control & Prevention Centre of Chengdu City, Chengdu 610041, China)

Abstract:The test is going to optimize the extraction process of Qilan granules.The contents of Epigoitrin,Calycosin-7-glucoside and yield of dry extract are used as indicators.The optimal extraction time is tested by orthogonal design L9(34).Extraction frequency and water consumption both have influence on the extraction process of Qilan granules.The results show that the optimal extraction process is as follows:the material liquor ratio of 1∶8,2 h every time and 3 times.Finally,a conclusion is drawn that the optimal extraction process obtained is reliable,stable and can be applied in industrial production.

Key words:qilan granules;epigoitrin;orthogonal test

中图分类号：R284.2；S853.7

文献标志码：A

作者简介：严鑫(1988 — )， 男， 硕士研究生， 从事中药药效与毒理研究.

收稿日期：2015-12-23.

文章编号：1004-5422(2016)01-0013-03