化工厂废水中对甲苯磺酸降解菌的筛选及降解特性研究

沈　洁，李加友，陆筑凤，蔡丽玲（嘉兴学院生化学院，浙江　嘉兴　314001）



化工厂废水中对甲苯磺酸降解菌的筛选及降解特性研究

沈洁，李加友，陆筑凤，蔡丽玲
（嘉兴学院生化学院，浙江嘉兴314001）

摘要：以对甲苯磺酸为唯一碳源，从化工厂供试废水中筛选出对甲苯磺酸降解菌，经形态学观察和分子生物学鉴定，确定这种菌株为哈茨木霉菌，命名为哈茨木霉1228。利用固态发酵的方法制备哈茨木霉1228，培养物直接投入化工厂供试废水进行处理，结果发现：在pH=5、温度30℃时，处理7 h后，化工厂供试废水中对甲苯磺酸降解率可达45%。

关键词：对甲苯磺酸；生物降解；哈茨木霉；降解特性

芳香族化合物作为一类重要的化工原料与中间体，正以每年百万吨的数量被制造出来，它们广泛用于有机合成、染料、塑料等行业。这类化合物有苯环或者多个苯环结构，具有相当大的毒性和致癌、致突变作用，且化学性质稳定，故其残留在生态系统中，对环境和人类健康造成危害[1-2]。目前，国内外工厂对废水中芳香族化合物的处理主要用物理化学方法，但大都存在运行费用高，处理效果不理想并且容易造成二次污染等诸多缺点。微生物降解环境污染物由于投资少、占地小又不需特殊设备而成为最有前途的治理环境污染的方法[3-4]。自然界中的许多好氧和厌氧微生物可以降解芳香族化合物[5-10]。

对甲苯磺酸是农药、医药、染料及有机合成等工业生产中的中间体原料，已广泛应用于制备树脂的固化剂和有机合成反应的催化剂[11]。对甲苯磺酸具强刺激性，对水体和大气都会造成污染，吸入、摄入或经皮肤吸收后都会对人体健康造成危害。化工厂废水中，因对甲苯磺酸的含量较高，废水酸性强，工厂常规的处理方法无法达到理想效果；且废水中含盐量大，菌种不易生长降解。本研究主要通过自然选育法从化工厂供试废水中选育出对甲苯磺酸降解菌，并考查其直接投菌的处理化工厂供试废水时的降解特性，为化工厂含甲苯磺酸废水的修复处理提供理论依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1供试废水

采自浙江嘉化能源化工股份有限公司化工厂含有对甲苯磺酸的未经处理的废水。

1.1.2主要仪器及化学试剂

主要仪器：液相色谱仪（1200 series，美国Agilent）、气质联用仪（7890A-5975C，美国Agilent）、恒温震荡摇床（QYC-211，上海福玛实验设备有限公司）、高速离心机（TD5A-WS，长沙湘仪离心机仪器有限公司）

化学试剂：对甲苯磺酸（浙江嘉化能源化工股份有限公司化工厂生产，纯度≧98%），其余化学试剂均为分析纯试剂。

1.1.3培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白陈10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，H2O 1000 mL，pH 7.2～7.4。

PDA养基：土豆100 g，蔗糖20 g，琼脂15～ 20 g，H2O 1000 mL，自然pH。

无糖无机盐培养基：Na2NO33 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，FeSO40.01 g，琼脂15～ 20 g，H2O 1000 mL，pH 7.2～7.4。

1.2实验方法

1.2.1对甲苯磺酸降解菌的筛选

从供试废水中筛选出降解对甲苯磺酸的活性菌株。具体方法如下：供试废水经适当稀释，在牛肉膏蛋白胨培养基或PDA培养基（含有1 g·L-1的对甲苯磺酸）平板涂布，放置在35℃或28℃培养箱中培养72 h。将有生长的菌种分别标记，并在牛肉膏蛋白胨培养基或PDA培养基（含有1 g· L-1的对甲苯磺酸）上划线纯化。纯化好的菌种，分别接于50 mL无糖无机盐培养基（含有5 g·L-1的对甲苯磺酸）中，放置在35℃或28℃恒温摇床中，130 r/min，初筛培养48 h。初筛了的菌种再次转接到50 mL无糖无机盐培养基（含有5 g·L-1的对甲苯磺酸）中，放置在35℃或28℃恒温摇床中，130 r/min，驯化培养48 h，得到对甲苯磺酸的耐受菌。选取对甲苯磺酸为单一碳源时的生长最好的菌种，挑取单菌落，反复划线纯化得到纯菌种，即对甲苯磺酸降解菌，于4℃冰箱保藏备用。

1.2.2对甲苯磺酸降解菌的观察及鉴定

筛选得到的对甲苯磺酸降解菌经纯化培养，在光学显微镜进行形态学观察，初步判断降解菌为真菌，采用分子生物学进行鉴定。

1.2.3对甲苯磺酸降解菌的固态发酵

取当年新鲜的水稻秸秆，用粉碎机进行粉碎过筛，筛孔直径0.5 cm。称取1000 g水稻秸秆粉于发酵桶中，加3000 mL水和速腐剂，充分搅拌均匀，接种对甲苯磺酸降解菌，使菌种充分与秸秆接触，于28℃恒温室中发酵培养8天，得到的发酵基质即为工业废水处理用的对甲苯磺酸降解菌。发酵培养物直接称重，加入待处理的供试废水中进行降解处理。

1.2.4对甲苯磺酸降解菌的降解特性研究

取供试废水50 mL装于250 mL锥形瓶中，分别调节一定pH值，添加一定的接菌量，28℃下摇床培养一定时间，计算得到对甲苯磺酸降解率。

1.2.5对甲苯磺酸的检测

采用外标法用液相色谱仪检测培养后残留的对甲苯磺酸浓度，检测条件为：柱：C-18；流动相为：乙腈：水：磷酸=240：235：0.15；检测波长为：254 nm；流速=0.8 mL/min。

对甲苯磺酸标准曲线公式：y = 1×106x-1912.7（R2= 0.9915）。

对甲苯磺酸降解率（%）=（初始对甲苯磺酸的量-对甲苯磺酸残余量）/初始对甲苯磺酸的量× 100%

2　结果与讨论

2.1对甲苯磺酸降解菌的筛选及鉴定

经过初筛、复筛后，在对甲苯磺酸为单一碳源时，有1株真菌生长明显优于其他菌种。将此菌种经纯化培养，成为对甲苯磺酸的降解菌，并对其进行形态学观察（图1、图2）和鉴定。

该降解菌在菌落为圆形，菌丝初为白絮状，后为暗绿色。菌落的局部有色素合成，呈现淡黄色。普通光学显微镜观察表明：菌丝纤细无色，多分枝，纵横交错。结合菌落形态和显微镜检结果，根据《真菌鉴定手册》，发现该降解菌属于木霉属。对该降解菌的ITS序列BLAST分析可知，该菌属于哈茨木霉（Trichoderma harzianum）（菌种登入号：HQ011501.1），我们将其命名为哈茨木霉1228。

图1　对甲苯磺酸降解菌的菌落形态

图2　对甲苯磺酸降解菌的显微镜观察

2.2对甲苯磺酸降解菌的降解特性研究

2.2.1体系初始pH对哈茨木霉1228降解对甲苯磺酸的影响

取化工厂工业废水50 mL装于250 mL锥形瓶中，分别调节pH值至5、6、7、8，添加25%的接菌量，30℃下摇床处理5 h，测定残余对甲苯磺酸含量，分别计算得到其降解率。实验做三组平行实验。

图3　pH对对甲苯磺酸降解率的影响

实验结果（图3）表明，对甲苯磺酸在酸性或碱性环境中降解率都较低，在pH=7的中性环境中降解率最高，这可能是由于哈茨木霉1228中降解对甲苯磺酸的酶属于一种中性酶，因此对甲苯磺酸在中性环境中降解率最高。

2.2.2菌种添加量对哈茨木霉1228降解对甲苯磺酸的影响

取供试废水50 mL装于250 mL锥形瓶中，调节pH值至7，分别添加5%、10%、15%、20%、25%的接菌量，30℃下摇床培养5 h，计算得到对甲苯磺酸降解率。实验做三组平行实验。

当添加量增加时，哈茨木霉1228发酵过程中产生的降解对甲苯磺酸所起作用的酶的量也随之增加，酶量的增加导致催化效率升高，从而降解率升高。但考虑到实际工业应用成本及操作，菌种添加量不易过大。

2.2.3降解时间对哈茨木霉1228降解对甲苯磺酸的影响

取供试废水50 mL装于250 mL锥形瓶中，分别调节pH值至5，添加25%的接菌量，30℃下摇床培养，分别于5 h、6 h、7 h、8 h、9 h取样检测，计算得到对甲苯磺酸降解率。实验做三组平行实验。

图4　菌种添加量对降解率的影响

图5　降解时间对哈茨木霉1228降解对甲苯磺酸的影响

酶降解底物受反应时间的影响，随着反应时间的增加，对甲苯磺酸降解率随之增加，当反应时间到达7 h降解率最高。但7 h后延长降解时间，对甲苯磺酸的降解率没有明显提高。因此，供试废水的处理时间为7 h。

2.2.4Cu2+添加量对降解率的影响

取化工厂工业废水50 mL装于250 mL锥形瓶中，调节pH值至5，添加25%的接菌量，分别添加0.2‰、0.4‰、0.6‰、0.8‰、1‰的Cu2+溶液，30℃下摇床处理5 h，测定残余对甲苯磺酸含量，分别计算得到其降解率。实验做三组平行实验。

实验发现：随着Cu2+浓度增加，对甲苯磺酸的降解率明显增加，当Cu2+浓度为1‰的时候，对甲苯磺酸的降解率比同等条件下不添加Cu2+降解率提高了60%。这说明Cu2+对哈茨木霉1228降解对甲苯磺酸的酶有明显的促进作用。

图6　Cu2+添加量对对甲苯磺酸降解的影响

3　结论

目前，化工企业的废水处理多是先经过复杂的物理化学处理，再进行微生物处理，耗时耗力。本实验将化工厂未经任何处理的一次废水，首先经过微生物处理，将主要有毒有害物质大部分清除，再经过一定处理即可以达到废水的排放标准，而且本实验处理时间短（7 h）。这为化工企业废水处理提供了新的思路，对治理化工废水起到了十分重要的现实意义。

本研究筛选的哈茨木霉1288，在pH=7时添加量为25%，温度30℃，降解7 h，对甲苯磺酸降解率达到45%。本研究对废水处理效果较明显，如经进一步优化处理，降解率可进一步提升。

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[11]康小锋，袁志国，金国良，等.对甲苯磺酸合成工艺的研究进展[J]中国胶粘剂，2015，24（3）：53-56.

材料化学

Isolation and Degradation Characteristics of a New p-Toluenesulfonic Acid Degrading Strains from Chemical Plant Wastewater

SHEN Jie，LI Jia-you，LU Zhu-feng，CAI Li-ling
（College of Biological and Chemical Engineering，Jiaxing University，Jiaxing，Zhejiang 314001，China）

Abstract:The p-toluenesulfonic acid（p-TSA）degrading strain was isoloated from chemical plant wastewater，which can use p-TSA as the sole carbon nutrition for growth．The degrading strain was identified as Trichoderma harzianum based on the results of morphological observation and molecular biological analysis，and it was named Trichoderma harzianum 1228. Trichoderma harzianum 1228 was preparation for treatment of wastewater from chemical plant by solid state fermentation method. The results showed that，the degradation rate of p-TSA can reach 45% when the chemical plant was treated with 5 h at pH=5 and 30℃.

Keywords:p-toluenesulfonic acid（p-TSA）; biological degradation; Trichoderma harzianum; degradation characteristics

作者简介：沈洁（1978-），女，吉林市人，实验师，主要研究生物发酵及其相关研究。E-mail：41615491@qq.com。

基金项目：嘉兴市科技计划项目（2014AY21009）；浙江省芳烃磺酸工程技术研究中心开放基金项目（84214001-6）。

文章编号：1006-4184（2016）3-0034-04

修回日期：2016-01-20