高效烟碱降解菌A4发酵条件优化

李俊刚++姜立春++马家俊

摘要：为了提高烟碱降解菌A4降解烟碱的能力，采用单因素试验和正交试验法对菌株A4发酵条件进行了优化。结果表明，通过单因素试验确定了影响菌株A4生长的培养基主要因素为pH值、烟碱含量、碳源、氮源；采用4个因素3个水平进行正交分析，确定了发酵的最佳条件为：在培养温度为30 ℃、pH值7.0、烟碱含量2.0 g/L、接种量 5.0%、柠檬酸三钠0.3%、胰蛋白胨1.5%条件下，培养48 h，其烟碱降解率为72.8%比优化前提高了22.5%。结果为采用生物技术降解烟碱废弃物以及改善烟叶品质方面提供了良好的菌种资源。

关键词：烟碱；烟碱降解菌；生物降解；条件优化；正交试验

中图分类号： TS41+4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0431-04

烟碱（nicotine）又名尼古丁，是烟草生物碱的主要成分，占烟草生物碱的95%以上，是影响烟叶品质的重要因素之一[1-2]。一般来讲，烟碱含量高的烟叶，烟气劲头大，反之则小。烟碱含量较高的烟叶可利用性比较差，传统物理和化学方法降解烟碱不仅会影响环境，甚至对人类造成危害。利用微生物降解烟碱含量不仅高效，而且具有一定的选择性，可用于降解烟草中烟碱和环境中被烟碱污染的废弃物，对香烟品质不会产生不利的影响，并满足消费群体对低烟碱卷烟的需求[3-6]。

目前，国内外已有报道筛选分离出一些烟碱降解菌株[7-8]，这些微生物可以在烟草工业和处理烟草废弃物中发挥重要作用。Tashiro等从44个含有烟碱的土壤和废水取样中获得57种细菌，这些细菌都呈短棒状，用烟碱作为唯一碳氮源，在2周内能降解浓度为1.0 g/L的烟碱[9]。孔雯等从湖北省襄阳市烟草种植地中分离得到1 株烟碱降解菌，初步确定为烟碱节杆菌属（Arthrobacter sp.），该菌在烟碱质量浓度为4 g/L的培养基中培养48 h后烟碱降解率达71% 以上[10]。2005年，阮爱东等筛选出1株假单胞菌（Pseudomonas sp. HF-1），该菌在培养基中培养25 h，烟碱浓度为1.3 g/L，测得烟碱降解率为99.6%[11]。袁勇军等从福建三明烟区的土壤中分离得到一种菌，经过鉴定属于为中间苍白杆菌，该菌36 h降解了9756% 的烟碱，当烟碱的浓度低于2 g/L时，菌株能完全降解烟碱[12]。本研究从川渝中烟工业公司四川公司绵阳分厂的垃圾堆废弃烟渣中筛选后获得优良降解烟碱菌株A4，研究了不同烟碱浓度和不同培养条件下该菌株对烟碱的降解能力，旨在为降低烟叶烟碱含量、提高烟叶可用性等提供理论依据。1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株节杆菌属A4菌株，本课题组从川渝中烟工业公司四川公司绵阳分厂的垃圾堆废弃烟渣中筛选后获得的优良降解烟碱菌株，经形态鉴定、生理生化特性测定和16S rRNA系统分析，初步鉴定为节杆菌属，保存于绵阳师范学院微生物实验室。

1.1.2烟碱培养基K2HPO4 13.3 g，KH2PO4 4.0 g，酵母提取物1.0 g，微量元素溶液10 mL，加蒸馏水至1 000 mL，pH值70，培养基经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min后，加入一定量烟碱（用0.22 μm滤膜过滤），固体烟碱培养基添加2.0%琼脂[4]。

1.1.3微量元素溶液MnSO4·7H2O 0.4 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，FeSO4·7H2O 0.2 g 使用0.1 mol/L HCl定容至100 mL[5]。

1.2主要试剂与仪器

烟碱含量≥98%，宜阳县天成生化有限责任公司；WFZ-UV-2000紫外分光光度仪，SC-3610低速离心机，KYC-100C恒温气浴式振荡器，Sanyo高压蒸汽灭菌锅，YT-CJ-1N超净工作台等。

1.3方法

1.3.1菌悬液的制备接种1环A4菌到装有10 mL烟碱液体培养基的试管中，于28 ℃下150 r/min培养48 h。再将这 2 mL 菌悬液接种到100 mL液体培养基中，在相同条件下培养48 h。

1.3.2烟碱含量测定将纯化菌株接入烟碱培养基中，于30 ℃、150 r/min 摇床培养，以未接菌的烟碱培养基为空白对照。发酵液于8 000 r/min离心20 min，上清液用0.05 mol/L HCl溶液稀释至合适的吸光度范围。以0.05 mol/L HCl溶液为参比，进行全波长扫描，测得烟碱最大吸收波长为260 nm，在此波长下计算烟碱降解率：烟碱降解率=（初始培养液中烟碱含量-发酵液中烟碱含量）/初始培养液中烟碱含量×100%。

1.3.3单因素试验对A4菌株初始pH值、培养时间、烟碱浓度、接种量、培养温度等发酵条件进行单因素优化。分别设置发酵培养基中5、6、7、8、9的不同初始pH值；20、25、30、35、40 ℃的不同培养温度；6、12、18、24、48、72 h不同培养时间；0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 g/L的不同烟碱浓度；0.5%、1.0%、20%、3.0%、5.0%、8.0%的不同接种量。120 r/min摇床培养48 h后测定培养液中烟碱的吸光度，测得不同单因素条件下的烟碱降解率，每个因素设置3个平行，取平均值。

1.3.4不同培养基组分对菌株降解烟碱的影响分别以含量为2.0 g/L的萄葡糖、蔗糖、柠檬酸三钠、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉等碳源添加培养基中，用于筛选最适碳源[13]；分别以含量为10 g/L的胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸铵、氯化铵等氮源添加培养基中，用于筛选最适氮源。

1.3.5正交试验为确定最适合烟碱降解条件，根据单因素试验结果，选择对降解烟碱影响较大的4个因素，即A：pH值；B：烟碱浓度；C：柠檬酸三钠；D：胰蛋白胨，设计了4个因素3个水平的正交试验L9（34），以烟碱降解率为指标进行试验（表1），确定复合因素对菌株A4降解烟碱的影响。

2结果与分析

2.1烟碱标准曲线绘制

分别吸取烟碱质量浓度为1.0 g/L的工作液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，用浓度为0.05 mol/L的盐酸溶液定容到50 mL，稀释至0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012、0.014 mg/mL。用同浓度的盐酸溶液做参比，在此波长下测量不同浓度烟碱的吸光值，以烟碱浓度为横坐标，吸光度为坐标轴绘制烟碱含量标准曲线（图1）。吸光值（y）与烟碱含量（x）呈现良好的线性关系，回归方程为y=38.929x-0.008 2，相关系数r=0.999 3。

2.2单因素培养条件优化

2.2.1不同pH值对菌株降解烟碱的影响在初始pH 值不同的条件下，在150 r/min、30 ℃下振荡培养72 h，试验结果见图2。结果表明，在pH值为6.0～7.5时，菌株降解烟碱的效果比较好。当pH值为7.0时，降解效果最好，其降解率达 27.5%；而pH值<6.0或>8.0时菌株降解烟碱的能力下降较快。通常认为培养基中的氢离子和氢氧根离子间接的对微生物产生影响，起初作用于胞外可解离的弱酸或弱碱，容易形成透过细胞膜的游离态进入胞内，再作用于参与代谢的各种酶类，从而影响菌体的生长和酶的合成，进而影响菌株A4对烟碱的降解率[14]。因此，烟碱降解菌A4的最适降解pH值为7. 0。

2.2.2不同培养时间对菌株降解烟碱的影响在培养时间不同的条件下，在150 r/min、pH值为7.0、温度为30 ℃条件下振荡培养72 h，每隔6 h取样测烟碱浓度1次，试验结果见图3。结果表明，烟碱浓度随菌株培养时间的延长而降低，其降解率逐渐升高；在48 h时，培养液中烟碱浓度仅为 1.27 g/L，其降解率达36.5%，此后随着培养时间的延长，其烟碱降解率变化不大。因此，选择48 h为菌株最适培养时间。

2.2.3不同烟碱浓度对菌株降解烟碱的影响在培养基中烟碱浓度不同的条件下，在150 r/min、pH值为7.0、温度为30 ℃条件下振荡培养48 h，结果表明，当烟碱质量浓度为0.1～2.0 g/L 时，随着浓度的升高，烟碱降解效率逐渐升高；在浓度为2.0 g/L时，其降解率最高，为35.8%。当浓度高于 2.0 g/L 时，烟碱降解率迅速下降，当浓度达到3.0 g/L时，其降解率最低，为13.3%（图4），这可能由于高浓度烟碱对细胞具有毒害作用，抑制了其生长从而影响了对烟碱的降解。因此，烟碱降解菌A4最适初始烟碱浓度为2.0 g/L。

2.2.4不同接种量对菌株降解烟碱的影响在培养基中接种量不同的条件下，在150 r/min、pH值为7.0、温度为30 ℃条件下振荡培养48 h，结果表明，随着接种量的升高，其烟碱降解率也逐渐增高，当接入量为0.5%～5.0%时，随接入量的增加，降解率上升较快，但接入量高于5.0%时降解率趋于平稳（图5）。因此，选择5.0%作为最适接种量。

2.2.5不同培养温度对菌株降解烟碱的影响在培养基中培养温度不同的条件下，在150 r/min、pH值为7.0、接种量为5.0%条件下振荡培养48 h，结果表明，温度过低或过高对烟碱的降解都有较大影响，在温度为25～35 ℃，菌株降解效果较好，在30 ℃时降解率达到最高，为54.2%（图6）。因此，选择 30 ℃ 作为最适培养温度。

2.3培养基成分优化

2.3.1不同碳源对菌株降解烟碱的影响在基础培养基中改用了不同碳源，考察不同碳源对菌株A4降解烟碱的影响，碳源是不可缺少的重要元素之一，不同的碳源会影响微生物的生长和降解酶的合成。从图7可以看出，A4菌株降解率随着培养液中添加的碳源不同其降解率也随之改变。当培养液中添加柠檬酸三钠为碳源时，菌株的降解率最大，为46.1%，且对烟碱降解影响较大。当培养液中分别添加乳糖、麦芽糖、蔗糖和淀粉作为碳源时，A4菌株的降解率依次为23.3%、30.2%、26.5%和26.3%，其中以葡萄糖作为碳源时的降解率最低，为21.5%。因此，选择柠檬酸三钠作为最适碳源。

2.3.2不同氮源对菌株降解烟碱的影响在基础培养基中改用了不同氮源，考察不同氮源对菌株A4降解烟碱的影响。从图8可以看出，A4菌株降解率随着培养液中添加的氮源不同其降解率也随之改变。当培养液中添加胰蛋白胨作为氮源时，菌株的降解率最大，为50.3%，当培养液中分别添加牛肉膏、酵母粉和氯化铵作为氮源时，A4菌株的降解率依次为40.3%、48.8%、31.2%，其中以硝酸铵作为氮源时的降解率最低，为23.2%，表明该菌株不能很好地利用无机氮源。因此，选择胰蛋白胨作为最适碳源。

2.4正交试验

为了更好地提高烟碱降解率，本研究选择了影响烟碱降解较大的4个因素，即pH值、烟碱浓度、柠檬酸三钠和胰蛋白胨含量，进行3个水平的正交试验，以进一步提高烟碱降解率。在不同条件下，以降解率为指标分析烟碱降解条件，结果见表2。由极值R值可知，不同因素对试验结果的影响依次为：B>A>C>D；从方差分析可看出，因素B的主效应很显著，即烟碱浓度对菌株降解效率有较大影响，其次是pH值和柠檬酸三钠，最后为胰蛋白胨（表3）。综合各种因素得出，4个因素正交试验降解烟碱适宜条件最优水平组合为A2B2C3D3，即：pH值为7.0，烟碱浓度为2.0 g/L，柠檬酸三钠浓度为0.3%，胰蛋白胨含量为1.5%（表2）。

2.5验证试验

为了验证试验结果的准确性，依据正交试验优化得到的最适培养基组成进行试验。3个平行试验结果表明，经过正交优化培养基后烟碱降解率为72.8%，比优化前50.3%提高了44.7%，可见优化后的培养基能明显提高菌株A4对烟碱的降解能力。

3结论

通过以烟碱降解率为指标的单因素和正交试验，确定A4菌株的最优烟碱降解方案：即pH值7.0、接种量5.0%、柠檬酸三钠含量0.3%、胰蛋白胨含量1.5%、烟碱含量2.0 g/L，温度30 ℃、150 r/min摇床培养，以上述优化组合培养48 h后测定培养液中烟碱的吸光度，其烟碱降解率达到72.8%，同单因素培养条件下的降解率50.3%相比，提高了44.7%，优化后的组合有明显的降解优势。该试验结果表明，烟碱降解菌A4 对烟碱具有较强的代谢降解能力，这将为利用生物技术降解烟碱废弃物和降低烟叶中烟碱含量提供良好的菌种资源。

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