慢阻肺大鼠肺泡灌洗液和外周血中树突状细胞趋化因子受体水平变化及意义

孙得胜，刘虹延,令狐阳,顾延会,欧阳瑶

(1遵义医学院附属医院，贵州遵义563003；2华中科技大学同济医学院附属同济医院)



·基础研究·

慢阻肺大鼠肺泡灌洗液和外周血中树突状细胞趋化因子受体水平变化及意义

孙得胜，刘虹延1,令狐阳1,顾延会,欧阳瑶1

(1遵义医学院附属医院，贵州遵义563003；2华中科技大学同济医学院附属同济医院)

摘要：目的观察慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)大鼠肺泡灌洗液(BALF)和外周血中树突状细胞趋化因子受体(CCR)6、CCR7水平变化，并探讨其临床意义。方法 将30只Wistar大鼠随机分为对照组、慢阻肺模型组、CCL20单抗组各10只，后两组用气道内注入脂多糖联合烟雾刺激的方法诱导慢阻肺模型，CCL20单抗组在造模前腹腔注射CCL20单克隆抗体。造模第29天观察大鼠肺组织病理变化，用ELISA法检测BALF及外周血中CCR6、CCR7水平。结果慢阻肺模型组肺组织HE染色符合慢阻肺的典型病理表现，CCL20单抗组肺部病理变化比慢阻肺模型组减轻。慢阻肺模型组BALF中CCR6水平高于对照组、CCL20单抗组(P均<0.05)，BALF中CCR7水平低于对照组(P<0.05)；而CCL20单抗组BALF中CCR7水平与慢阻肺模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组外周血中CCR6、CCR7水平比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 慢阻肺大鼠BALF中CCR6水平升高、CCR7水平降低，而外周血中CCR6、CCR7水平变化不明显，CCL20单抗可抑制CCR6水平升高以减轻病情。

关键词：慢性阻塞性肺疾病；树突状细胞；趋化因子受体6；趋化因子受体7；大鼠

慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)全球倡议认为气道和肺组织对有害气体或颗粒的异常炎症反应是其重要特征[1]。在慢阻肺的炎症反应过程中有免疫细胞被募集到肺[2]。慢阻肺中的免疫应答是在特定的抗原驱使下完成的[2]，同时受树突状细胞(DC)的严密调控[3]。在外来抗原侵袭机体时，DC从完好的上皮组织移行到受侵袭的部位并摄取这些抗原[4]。DC继续迁移到局部引流淋巴结，提呈所摄取的抗原给相关的T细胞。DC的迁移在其趋化因子受体(CCR)与相关的趋化因子间的相互作用下完成[5]。我们于2011年5月~2014年12月，检测慢阻肺大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)及外周血中DC的CCR6、CCR7水平，探讨其临床意义。

1材料与方法

1.1实验材料标准实验用清洁级雄性Wistar大鼠30只(由第三军医大学实验动物中心提供)，出生56 d，体质量200~220 g。Monoclonal Anti-rat CCL20 Antibody(R&D Systems公司)，大鼠CCR6、CCR7 ELISA试剂盒(上海西唐生物科技公司)，LPS(Sigma公司)，香烟(烟气烟碱量1.2 mg、焦油13 mg、烟气一氧化碳14 mg，遵义牌，贵州中烟工业有限责任公司)。

1.2模型建立将大鼠随机分为对照组、慢阻肺模型组和CCL20单抗干预组，各10只。根据参考文献[6]制备慢阻肺模型。分别于第1、15天大鼠气道内注入细菌内毒素脂多糖(LPS)溶液内被动吸烟(每天2次，每次间隔2 h，每次燃12支香烟)。对照组不予上述处理，CCL20单抗组大鼠第1天注入LPS前腹腔注射CCL20单克隆抗体100 μg。

1.3支气管肺泡灌洗液(BALF)及外周血中CCR6、CCR7检测造模第29天选取各组大鼠用直径约1 mm的毛细管从大鼠内毗球后静脉采集1 mL血，离心后取上清。大鼠麻醉后开胸，结扎右肺，剪取右肺下叶予多聚甲醛固定，制作石蜡标本及病理切片，并行HE染色，镜下观察肺组织病理变化。取右肺上叶放入低温冷冻管，并保存备用。在大鼠气管下段作一倒“T”形切口，插入内径约1 mm的塑料管，用注射器缓慢注入4 ℃生理盐水5 mL，并轻柔按摩大鼠肺脏行支气管肺泡灌洗3次，将回抽的灌洗液保存，采用ELISA法检测各组BALF及外周血中CCR6、CCR7。实验重复4次，取平均值。

2结果

2.1各组肺组织病理变化对照组肺泡结构完整连续，肺泡壁完好，小支气管未见炎性细胞浸润及腺体。慢阻肺模型组部分肺泡间隔增宽，在增宽的肺泡间隔内可看到毛细血管扩张充血，并伴有淋巴细胞、中性粒细胞及单核细胞浸润；部分肺泡间隔出现变窄、断裂甚至融合，符合慢阻肺的特征性病理表现特点。CCL20单抗组肺泡腔稍增大，伴有肺泡间隔增宽，可见炎性细胞的浸润，但与慢阻肺模型组相比其病理改变的程度显著减轻。

2.2各组BALF及外周血中CCR6、CCR7水平比较见表1。

表1　各组BALF及外周血中CCR6、

注：与对照组比较，*P<0.05；与慢阻肺模型组比较，#P<0.05。

3讨论

慢阻肺是以不完全可逆、呈进行性发展的气流受限为特征的气道慢性炎症性疾病，吸烟和感染被公认是引起慢阻肺发病的最主要的环境因素。我们对大鼠进行烟雾刺激并注射LPS诱发感染以模拟这种病理生理过程，28 d后慢阻肺模型组病理改变结果与文献[6]报道一致，符合慢阻肺病理的特征性表现；而CCL20单抗组大鼠肺部病理表现比慢阻肺模型组明显减轻。

本研究结果表明，慢阻肺大鼠BALF中CCR6的水平均较对照组增多。CCR6是未成熟DC(iDC)的CCR[7]，作为与iDC紧密相连的CCR6可看作iDC自身结构的一部分，当气道发生炎症反应时，在炎症介质的刺激下，部分CCR6带动iDC从其“储备库”向肺部迁移[8]，故而可引起肺部iDC和CCR6的增多。CCL20是CCR6的配体[9]，二者相互作用被认为是iDC被募集的一个可能的重要机制。本研究结果显示，CCL20单抗组BALF中CCR6水平低于慢阻肺模型组(P<0.05)。这很可能由于CCL20抗体结合了大量的CCL20，从而使能与CCR6相互作用的CCL20显著减少，致使被趋化到肺部的CCR6减少，同时也使慢阻肺病情减轻。BALF中CCR7水平比较，慢阻肺模型组低于对照组，CCL20单抗组与慢阻肺模型组无统计学差异。这是因为CCR7是成熟DC的受体[10]，其配体是CCL19和CCL21[11]，而不是CCL20，所以注射该单抗后对体内的CCR7并没有发生直接的作用。本研究中各组外周血中CCR6、CCR7水平比较差异均无统计学意义，原因可能为趋化活动中发生迁移的CCR的数量与外周血内的总量比太少，所以对外周血中CCR6、CCR7的水平没有产生明显的影响。

总之，慢阻肺的发病可能与肺部CCR6水平升高及CCR7水平降低有关，使用CCL20单抗能部分抑制这一效应，使病情减轻。然而，在慢阻肺的炎症反应中多种CCR起着调控作用，需要同时抑制多种CCR才能达到理想的治疗效果，有待于以后的研究中进一步探索。

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(收稿日期：2015-12-11)

中图分类号：R563

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)09-0024-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.008

通信作者：欧阳瑶(E-mail：ouyangyao116@sohu.com)

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81460008)。