N-乙酰半胱氨酸对野百合碱诱导大鼠肺动脉高压作用机制的基础研究

韩　冰　孟　晓　卜培莉

(济南市第六人民医院重症医学科，济南250200)



N-乙酰半胱氨酸对野百合碱诱导大鼠肺动脉高压作用机制的基础研究

韩冰孟晓①卜培莉①

(济南市第六人民医院重症医学科，济南250200)

[摘要]目的：观察N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)对野百合碱(Monocrotaline,MCT)诱导的肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension,PAH)大鼠右心室重构的影响及其机制。方法： Wistar雄性大鼠适应性喂1周，随机分为正常对照组、MCT 组、MCT+NAC组。MCT(60 mg/kg)皮下注射诱导PAH大鼠模型，实验组给予NAC[500 mg/(kg·d)]，连续6周，第4周末测定大鼠平均肺动脉压(mPAP)、右心室收缩压(RVSP)；分离大鼠左心室+室间隔(LV+S)、右心室(RV)并称重，计算RV/(LV+S)的比值。HE染色观察右心室病理学变化，天狼星红染色观察右心室胶原沉积的变化。RT-PCR和Western blot检测右心室collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)、核转录因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)mRNA和蛋白表达。结果：NAC连续给药4周后能明显降低MCT诱导的PAH大鼠RVSP及mPAP，减轻RV/(LV+S)的比值，改善右心室心肌细胞的病理变化，降低右心室胶原的沉积，抑制NOX4的表达和NF-κB的活化。结论：NAC能缓解野百合碱(MCT)诱导的肺动脉高压大鼠右心室重建，其机制可能是通过抑制NOX4介导的氧化应激损伤，和NF-κB 所介导的胶原沉积有关。

[关键词]N-乙酰半胱氨酸；野百合碱；肺动脉高压

肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension，PAH)是一种危害人类健康的非常严重的疾病，其形态学特征是肺小动脉血管结构重建，主要引起肺动脉压力升高、肺血管阻力增加、右心衰竭[1]。其主要病理机制是炎症和氧化应激的损伤相互促进的恶性循环过程[2]。大量研究表明氧化应激是引起 PAH 右心重构的重要原因，其中 NADPH 氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)诱导的氧化应激损伤参与了PAH 右心室重构[3,4]。另外有研究发现核转录因子κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)的活化参与PAH 心血管重构[5]，而NOX4介导的氧化应激可能通过增强对NF-κB的抑制蛋白IκB(Inhibitorka-ppa B)的解离，激活NF-κB与DNA的结合活性,进一步激活NF-κB转录因子[6]，促进生长因子、趋化因子、细胞因子、炎症介质和黏附分子等相关基因表达，参与了PAH心血管重构[7]。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是从半胱氨酸衍生而来的一种氨基酸，具有调节细胞的代谢活性、清除氧自由基；调整基因的表达和信号转导系统、抑制恶性肿瘤发展、预防DNA损伤等作用[8]。目前其抗炎和抗氧化应激作用已经广泛应用于临床各种疾病，例如对乙酰氨基酚中毒、特发性肺纤维化、支气管炎、缺血再灌注损伤、心肌损伤等[9]。最近研究报道，N-乙酰半胱氨酸通过抑制肺损伤模型大鼠中促炎因子TNF-α和IL-1β的释放以及NF-κB的激活，进而减少炎性细胞的释放并且改善白细胞和单核细胞的化学驱药性[10,11]。这些研究表明NAC具有保护机体免于氧化应激的损伤和右心室重构。

基于NAC的生物学功能，本实验提出这样的假设：NAC可能可以有效改善肺动脉高压患者的肺血管的重建。本实验通过体外注射MCT诱导并构建肺动脉高压大鼠模型，同时给予肺动脉高压大鼠NAC治疗，研究NAC对肺动脉高压大鼠的影响。

1材料与方法

1.1材料Wistar雄性大鼠，体重200～220 g，由华中科技大学动物实验中心提供，实验所用动物均符合国家医用动物使用标准(许可证号：SCXK[鄂]2012-2014，级别：SPF)，野百合碱(MCT)(Sigma，美国)，N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)(Sigma，美国)，TRIzol RNA 提取试剂盒(美国 Invitrogen 公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit、Power SYBR Green PCR Master Mix(大连宝生物工程有限公司)；collagenⅠ及 collagenⅢ单克隆抗体(美国 Abcam 公司)，β-actin、NOX4 及 NF-κB 单克隆抗体(美国 SantaCruz 公司)。

1.2方法

1.2.1实验分组60只雄性大鼠随机分为3组：①野百合碱诱导和N-乙酰半胱氨酸处理组(MCT+NAC，n=20)：本组大鼠首先给予MCT(60 mg/kg)皮下注射，每日一次，连续2周，同时给予NAC500 mg(kg·d)皮下注射，连续6周；②野百合碱诱导组(MCT，n=20)：本组大鼠实验前2周给予MCT(60 mg/kg)皮下注射，每日一次，同时自实验开始给予同NAC等体积的0.9%生理盐水皮下注射，每天一次，持续6周；③生理盐水对照组(n=20)：自实验开始至实验第6周给予同NAC等体积的0.9%生理盐水皮下注射，每天一次，另外实验开始前2周给予同MCT等体积的0.9%生理盐水皮下注射，每天一次。

1.2.2血流动力学指标的测定自实验开始，4周末对各组大鼠进行右心室收缩压(RVSP)、平均肺动脉压(mPAP)、右心室肥厚指数(RVHI)检测。分别于第2、4、6周用戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉。分离右颈外静脉，采用肝素钠导管经右颈外静脉行右心插管，调整并妥善固定导管位置后，用MedLab多导生理记录仪分别记录。

1.2.3组织标本收集与处理上述动力学指标检测完毕后，处死大鼠后迅速开胸分离心脏，预冷的PBS冲洗干净，随后准确分离右心室(RV)、左心室加室间隔(LV+S)，称重，计算RVHI=RV/(LV+S)。取右心室心尖部固定于4%多聚甲醛以备石蜡切片；剩余的右心室组织，-80 ℃冰箱保存，以备于相关指标的mRNA、蛋白表达水平的检测。

1.2.4右心室组织病理学及胶原沉积的观察取大鼠右心室心尖部4% 多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋切片，进行HE染色和天狼星红染色，分别观察右心室心肌细胞的病理变化及胶原沉积情况。

1.2.5RT-PCR检测右心室collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、NOX4、NF-κB mRNA的表达称重100g右心室组织，用1 ml Trizol 充分裂解组织后，氯仿抽提，异丙醇沉淀回收总RNA，测RNA浓度、逆转录后，所得cDNA以β-actin为内参照，在ABI-7300实时荧光定量PCR仪进行检测。重复3次。数据分析用 7300 System SDS Software 软件，统计ΔΔCt值。引物购买于美国origene公司，序列见表1。

表1引物序列

Tab.1Primer sequences

GenePrimersequenceCollagenⅠForwardsequence:CCTCAGGGTATTGCTGGACAACReversesequence:CAGAAGGACCTTGTTTGCCAGGCollagenⅢForwardsequence:GACCAAAAGGTGATGCTGGACAGReversesequence:CAAGACCTCGTGCTCCAGTTAGNOX4Forwardsequence:CGGGATTTGCTACTGCCTCCATReversesequence:GTGACTCCTCAAATGGGCTTCCNF-κBForwardsequence:CCAGGAGAAAGTCAGCCTCCTReversesequence:TCATACCAGGGCTTGAGCTCAβ-actinForwardsequence:CATTGCTGACAGGATGCAGAAGGReversesequence:TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG

1.2.6Western blot 检测右心室 NOX4 和 NF-κB 蛋白表达低温提取右心室蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取30 μg总蛋白与上样缓冲液充分混合后，95℃加热5 min，SDS-PAGE胶上电泳，转膜，5%BSA封闭1 h，分别加入1∶500～1∶2 000稀释后的相应的一抗，4℃孵育过夜。次日，充分洗涤后，分别加入相应HRP标记的二抗(稀释比例为1∶5 000)室温孵育1 h。ECL凝胶成像系统(ECL,USA)采集图像。实验独立重复3次。

2结果

2.1NAC对肺动脉高压大鼠血流动力学和右心室肥厚的影响与对照组比较，MCT诱导组大鼠在MCT皮下注射第4周末RVSP、mPAP明显增高，差异有统计学意义。因 RV/LV+S即(RVHI)是评价右心室肥厚程度的主要指标。与对照组相比，在MCT处理第4周末，MCT处理组RVHI明显增高(P<0.01)。而给予NAC治疗组，于治疗的第4周末，可以观察到RVSP、mPAP、RV/LV+S的明显改善，较MCT处理组均显著降低，差异有统计学意义。结果见表2。

2.2NAC对肺动脉高压大鼠右心室心肌细胞的病理变化和右心室胶原表达的影响右心室心肌细胞HE染色后400倍镜下观察，与对照组相比，野百合碱(MCT)处理组右心室心肌细胞增生肥大且排列紊乱、稀疏和胞浆肿胀，心肌细胞间隙增宽，而给予NAC治疗后于第4周末，可观察到上述病理变化有明显的改善，结果见图1A。同时天狼星红染色观察右心室胶原的表达，天狼星红染色显示胶原纤维为红色，可以观察到对照组右心室着色较淡，心肌细胞的间隙清晰可见，血管旁胶原分布稀疏。与对照组相比，MCT处理组大鼠右心室心肌细胞间质有较多明显红色胶原沉积；而NAC治疗组右心室心肌细胞间质和血管旁的红色深染较MCT组逐渐减少，胶原沉积现象也明显减轻。结果见图1B。

表2血流动力学数据

Tab.2Hemodynamic data

ControlMCTPNACp1RVSP(mmHg)40.52±5.24112.63±16.450.00170.23±12.340.03mPAP(mmHg)10.23±1.0240.78±4.760.0128.33±5.210.04RVHI0.28±0.030.72±0.070.010.41±0.090.02

图1　NAC对MCT诱导肺动脉高压大鼠右心室病理变化以及胶原沉积的影响Fig.1　NAC decreases cardiomyocytes hypertrophy and fibrosis in RV rats with PAHNote: In the first part(A),representative image of cardiomyocytes in RV of control rat(1)，MCT rats(2) and MCT rats treated with NAC after MCT exposure(3);in the second part(B),representative image of collagen(red stained)content in RV of control rat(1) MCT rats(2)and MCT rats treated with NAC after MCT exposure(3).

图2　NAC对右心室collagenⅠ、 collagen Ⅲ mRNA表达的影响Fig.2　Expression of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ mRNA was determined by RT-PCR in right ventricle of monocrotaline-induced pulmonary arterial hypert-ension of ratsNote: Comparison between two groups，*.P<0.01.

图3　NAC对右心室NOX4、NF-κB表达的影响Fig.3　Expression of NOX4 and NF-κB was deter-mined by RT-PCR and Western blot in right ventricle of monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension of rats after NAC treatmentNote: Comparison between two groups，*.P<0.01.

2.3NAC对右心室collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA表达的影响经RT-PCR检测发现，MCT处理组右心室collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA的表达较对照组明显增高。而与MCT组对比，NAC治疗组治疗第4周末collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的表达均有不同程度的下调，差异有统计学意义。结果见图2。

2.4NAC对右心室NOX4、NF-κB表达的影响经RT-PCR、Western blot检测发现，MCT处理组右心室NOX4、NF-κB mRMA、蛋白水平的表达均较对照组明显增高。而与MCT组对比，NAC治疗组治疗第4周末NOX4、NF-κB mRNA、蛋白的表达均有不同程度的下调，差异有统计学意义。结果见图3、4。

3讨论

随着学者们对PAH病理生理学机制和发病机制的深入研究，临床上对PAH的治疗也在不断改进。以前临床上主要是使用磷酸二酯酶-5抑制剂和内皮素受体拮抗剂等药物的治疗来改善患者的预后。目前更多新的治疗药物随着对PAH研究的深入不断被学者们提出并应用。

N-乙酰半胱氨酸最早在临床上用于治疗急性咳嗽，使痰中的黏蛋白裂解，降低分泌液的黏性而利于排出。随着近年来对N-乙酰半胱氨酸的深入研究，发现NAC还具有多种其他功能，如较强的抗炎、抗氧化、扩血管等多种生物活性，对呼吸系统疾病、肝炎、心血管疾病、肿瘤等有潜在的治疗作用。Gerrits等[12]收集1 219例慢性阻塞性肺疾病的患者资料进行临床研究，发现NAC可减少大约30%的COPD患者再住院风险，且这种疗效呈剂量依赖性。另外有研究显示NCA通过补充孤立心肌细胞内容谷胱甘肽，从而消除TNF-α对心脏的有害作用。NAC还可以改善肝功能衰竭患者的生存率主要机制如下：(1)增加NO的产量；(2)提高GSH的生物利用度；(3)调节淋巴细胞活性，抑制T细胞凋亡，使肝细胞的功能增强；(4)抑制重型肝炎患者炎症因子IL-8、NO和sicAM-1等的分泌，减少肝脏损伤[13]。

本研究通过野百合诱导，构建PAH大鼠模型，并给予NAC处理，结果显示NAC连续给药4周末，PAH大鼠的RVSP、mPAP、RV/LV+S显著降低；右心室心肌细胞的病理损伤明显减轻,胶原沉积明显并且胶原蛋白的表达显著下调，这些均提示NAC对PAH 大鼠具有降低肺动脉压力、减轻右心室重构和胶原沉积的作用。

肺动脉高压主要形态学改变是肺血管和右心室重构，目前其机制不是很明确。有研究发现NOX可以通过诱导氧化应激反应影响肺动脉高压患者肺血管重构及右心重构[14,15]。最近有学者研究发现在野百合碱诱导的PAH大鼠右心室NOX4表达明显增高，并且给予白杨素治疗后能够抑制NOX4的表达，从而减轻MCT诱导的肺动脉高压大鼠右心室病理变化和胶原沉积[16]。我们实验结果表明野百合诱导的PAH大鼠右心室NOX4的mRNA和蛋白水平均明显增高，同时给予N-乙酰半胱氨酸皮下注射治疗，4周后，PAH大鼠右心室NOX表达显著降低。这些结果与之前学者们的研究是一致的，表明NAC通过下调NOX4的表达而抑制PAH大鼠右心室重构。

NF-κB 是一种核转录因子，参与生物体内很多重要的生理反应过程。其中NF-κB 的活化在氧化应激损伤诱导肺动脉高压的形成进程中发挥重要作用[17,18]。而大量的研究表明NAC可以通过抑制NF-κB活化而实现抗炎、抗氧化等作用[19-21]。本研究结果发现,野百合碱诱导的 PAH 大鼠右心室 NF-κB的表达显著增高,而给予NAC皮下注射4周后能下调大鼠右心室 NF-κB mRNA 及蛋白的表达,表明NAC通过抑制NF-κB 活化从而保护PAH大鼠肺血管和右心室重构。

综上所述，NAC能够缓解MCT诱导的肺动脉高压大鼠肺血管和右心室的重构，其机制可能与抑制NOX4的表达和降低氧化应激损伤诱导的NF-κB活化有关。

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[收稿2015-11-06修回2016-01-29]

(编辑许四平)

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《中国免疫学杂志》编辑部

Effect of N-acetylcysteine in right ventricle of monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension of rats

HANBing,MENGXiao,BUPei-Li.

DepartmentofICU,Ji′nanSixthPeople′sHospital,Ji′nan250200,China

[Abstract]Objective:To investigate the protective effect of N-acetylcysteine(NAC)on right ventricular remodeling in a rat model of monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension(PAH).Methods: PAH rats were induced by a single injection of monocrotaline(60 mg/kg,sc)and were ad ministered with NAC[500 mg/(kg·d)]for 6 weeks.At the end of 4 weeks,the right ventricular systolic pressure(RVSP)and mean pulmonary artery pressure(mPAP)were monitored via the right jugular vein catheterization into the right ventricle.Right ventricle(RV)to left ventricle(LV)+septum(S)were calculated.Right ventricular morphological change was observed by HE staining.Sirius red was used to demonstrate collagen deposition.The expressions of collagen Ⅰ,collagen Ⅲ,NADPH oxidase 4(NOX4)and nuclear factor-kappa B(NF-κB)were analyzed by RT-PCR and(or) Western blot.Results: NAC attenuated RVSP,mPAP and right ventricular remodeling index(RV/LV+S) of PAH rats induced by monocrotaline after treatment for 4 weeks.Furthermore,monocrotaline-induced right ventricular collagen accumulation and collagen Ⅰ and collagen Ⅲ expression were both significantly suppressed by NAC.The expressions of NOX4 and NF-κB were obviously decreased in right ventricule from PAH rats with NAC treatment.Conclusion: NAC ameliorates right ventricular remodeling of PAH induced by monocrotaline in rats through down regulating the expression of NOX4 and antioxidant activity,and inhibiting activation of NF-κB and collagen accumulation.

[Key words]N-acetylcysteine;Monocrotaline;Pulmonary arterial hypertension

中图分类号R332

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)03-0345-05

作者简介：韩冰(1979年-)，女，在读硕士，主治医师，主要从事肺动脉高压、冠心病、心律失常等相关疾病的诊治工作，E-mail：hanbing368@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.011

①山东大学齐鲁医院心内科，济南250012。