参芎对大鼠肝纤维化血清MMP-3、TIMP-1水平的影响①

迟男男，艾迎春

(佳木斯大学附属第一医院消化二科，黑龙江 佳木斯 154003)



参芎对大鼠肝纤维化血清MMP-3、TIMP-1水平的影响①

迟男男，艾迎春

(佳木斯大学附属第一医院消化二科，黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的：通过研究肝纤维化大鼠的血清MMP-3、TIMP-1的水平及肝纤维化大鼠注射参芎注射液后的血清MMP-3、TIMP-1的变化，说明参芎注射液可能通过调节大鼠肝纤维化血清MMP-3、TIMP-1的水平，从而对肝纤维化的治疗有一定的作用。方法：将30只2月龄雄性SD大鼠随机分3组分别为正常对照组、模型组(肝纤维化组)、治疗组(参芎组)，每组10只。通过酶联免疫吸附试验法(ELISA法)观察比较造模后8周正常对照组、模型组(肝纤维化组)、参芎治疗组大鼠血清中的MMP-3、TIMP-1的水平。结果：与正常对照组比较,肝纤维化组及治疗组大鼠血清中的MMP-3、TIMP-1水平升高，差别有显著性(P< 0.05);与肝纤维化组比较，治疗组的大鼠血清中的MMP-3较治疗前升高， TIMP-1较治疗前减少，差别有显著性(P< 0.05);结论：参芎注射液可能通过对大鼠肝纤维化血清中的MMP-3、TIMP-1的水平影响，从而对肝纤维化的治疗有一定的作用。

关键词：MMP-3；TIMP-1；肝纤维化

肝纤维化(liver fibrosis)是可逆性病变，慢性肝病的重要病理特征为肝纤维化，且肝纤维化还是慢性肝病的病程发展的共同通路。肝硬化是肝脏疾病的常见病之一，而肝硬化是肝脏实质性病变，其病变是不可逆转，因此只能把改善肝细胞的功能及其相关并发症的对症治疗作为对肝硬化疾病的治疗重点。肝纤维化又是肝硬化的发生途径和其病理改变的基础，因此只要能影响肝纤维化过程的方法，其对肝脏疾病的病程发展也有着一定的影响，从而肝纤维化的治疗对控制肝脏疾病的发展有着重要的意义。肝纤维化发生的本质是肝脏内细胞外基质(ECM)的大量沉积，其发生过程涉及复杂的细胞、分子机制的动态过程。肝脏的ECM的代谢主要受MMPs及其抑制因子TIMPs 调节。本实验通过对比正常对照组的大鼠、模型组(肝纤维化组)的大鼠及治疗组(参芎组)的大鼠的血清中基质金属蛋白酶-3 (MMP-3) 及基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP -1)的水平，探讨参芎注射液是否可能通过对大鼠肝纤维化血清中的MMP-3、TIMP-1的水平影响，从而对肝纤维化的治疗有一定的作用，进而可能为肝硬化治疗提供了理论依据。

1材料及方法

1.1动物

选取30只，2月龄的清洁级雄性SD大鼠,体重(200±20)g, 常规饲养。此SD大鼠均购于本校实验动物中心。

1.2 实验方法

1.2.1建立肝纤维化大鼠模型

本实验采用单纯四氯化碳法诱发大鼠肝纤维化模型[1]，参考杨婷、范东旭传统肝硬化动物模型制备方法的改良[2]将30只SD大鼠随机分成3组，各组为10只。即正常对照组(n=15)，模型组(肝纤维化组)(n=15)及治疗组(参芎组)(n=15)。 正常对照组只给其饮用清水；模型组(肝纤维化组)的大鼠给其饮用酒精，随时间逐渐增长酒精浓度; 肝纤维化形成用橄榄油将四氯化碳配制成40%的油剂。首次注射以5mL/kg量对大鼠皮下注射，以后每次以3mL/kg量给予注射，每3天一次，持续至八周。治疗组(参芎组)于造模成功后给予腹腔注射参芎注射液(33.13mL/kg)14d。

在模型建立以后第8周，正常对照组大鼠、模型组(肝纤维化组)大鼠及治疗组(参芎组)大鼠分别在实验前10h禁食，然后用毛细管在眼眶取血1.5mL。血液样本在EP管中离心(4000r×10min)，取上清液。溶血严重的样品弃去不用。血清样品分离后立即冷冻保存，留待测定。

1.2.2 采用双抗体一步夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法

分别测定各组大鼠的血清中的MMP-3，TIMP-1的水平，并以计算TIMP-1/ MMP-3的比值。

1.3 统计学方法

2结果

与正常对照组比较，模型组(肝纤维化组)和治疗组(参芎组)的大鼠血清中的MMP-3、TIMP-1的水平及TIMP-1/ MMP-3的比值明显升高，差别有显著性(P<0.05)，具有统计学意义。与模型组比较，治疗组的大鼠血清中的MMP-3的水平明显升高， TIMP-1水平及TIMP-1/MMP-3的比值明显减少，差别有显著性，具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组别MMP-3TIMP-1TIMP-1/MMP-3治疗组#1937.68±13.09100.96±12.7119.07±1.12模型组*1905.17±19.34105.58±15.3920.97±1.27正常组 1223.14±192.0571.21±3.7417.11±1.46

#、*与正常对照组比较，P<0.05；#与模型组组比较，P<0.05。

3讨论

肝组织由于受到持续性的损伤-修复反应，从而导致肝组织内的细胞外基质的大量异常沉积，又进一步的使肝脏结构和肝功能发生异常的改变，而这种病理过程为肝纤维化过程，所以在肝内过渡沉积所导致的肝纤维又是肝硬化疾病的早期阶段，已有大量研究表明肝纤维化病程是可逆的，即肝纤维化是一个动态过程，是有关细胞外基质、多种细胞以及多种细胞因子等因素所参与及互相调节的过程，其过程是使大量细胞外基质( ECM )合成增多,降解减少，细胞外基质大量的异常沉积，从而导致肝纤维化的发生。从而也就说明肝组织内的细胞外基质沉积是由于各种细胞外基质成份的产生和降解之间的一个失平衡所导致的结果。而近些年的研究发现这种失衡的主要原因是MMPS和TIMPS两大酶系的病理性表达及相互作用[3，4]。目前对肝硬化真正副作用少、有效的西药很少，因此，中药已成为研究的新方向，活血化瘀中药对干预肝纤维化、改善肝病进展有一定的效果。目前，国内外学者已研究并观察了MPP-3、TIMP-1与肝纤维化形成的关系，并认为在肝纤维化的病程发展过程中MMP-3以及TIMP-1起到了主要作用[5]。参芎注射液的主要作用成分是丹参素和川芎嗪的中药合剂,每100mL中含盐酸川芎嗪100mg,丹参素20mg，其具有活血化瘀,抗血小板聚集,扩张冠状动脉,降低血液黏度,加速红细胞的流速,改善微循环,并具有心肌缺血和心肌梗死的作用。近年来,随着临床研究的不深入,其应用范围也有所拓展,目前对于其在肝纤维化引起的血清MMp-3、TiMP-1水平变化临床实验研究尚无报道。本课题拟通过建立大鼠肝纤维化模型, 研究参芎注射液对大鼠的血清中的MMP-3、TIMP-1的水平影响，从而对肝纤维化的治疗有一定的作用，进而可能为肝硬化治疗提供了理论依据。基质金属蛋白酶(MMPs)的作用主要是通过降解细胞外基质(ECM)，从而影响细胞外基质的重组和水解的动态平衡[6，7]。MMP-3可以降解细胞外基质的主要成分，如胶原蛋白、纤维蛋白、蛋白多糖、层粘连蛋白、弹性蛋白等。对肝纤维化病程的发展起到抑制作用。本实验检测结果显示，与正常组相比, 在模型组(肝纤维化组)的大鼠血清MMP-3水平明显升高，差异有显著性(P<0.05)。治疗组(参芎组)的大鼠血清MMP-3较模型组升高，但比正常对照组高，差异有显著性(P<0.05)。 体内存在多种可抑制MMPs活性的负性调节因子，其可对MMPs进入胶原基质起抑制作用，使MMPs与底物分离，从而对MMPs活性具有特异性地抑制作用，这种负性调节因子称为金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)[8]，它的特异性可以促进肝纤维化。TIMPs包含了四种天然类型，其中MMP-3的特异性抑制物是TIMP-1[9]。本文结果显示,TIMP-1水平及TIMP-1/MMP-3比值在模型组及治疗组大鼠的血清中水平明显增高,高于正常对照组，差异均有显著性(P<0.05)。与模型组比较，治疗组大鼠的血清中TIM P- 1水平及TIMP-1/MMP-3比值降低，差异均有显著性(P<0.05)。 本研究表明：参芎注射液可能通过对大鼠肝纤维化血清中的MMP-3、TIMP-1的水平影响，从而对肝纤维化的治疗有一定的作用。其具体机制尚有待进一步研究。

参考文献：

[1]N abeshim a Y,Tazum a S,K anno K,et al.A nti-fibrogenic function of angiotensin II type 2 receptor in CCl4-induced liver fibrosis.[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,34(63):658-664

[2]杨婷，范东旭，罗维.传统肝硬化动物模型制作方法的改良[J].黑龙江医药科学，2005,28(1):15-16

[3]中华肝脏病学会.肝纤维化诊断及疗效评估共识[J].中华肝脏病杂志,2002,5:260-270

[4]于建国,薛佩莲,吕敏和.病毒性肝炎及肝病学基础与临床研究的新进展[J].世界华人消化杂志,2002,10:713-716

[5]艾迎春，车立昱.参芎治疗肝纤维化的实验研究[J].黑龙江医药科学，2013,36(2):107

[6]Woessner JF, Nagase H. Matrix Metalloproteinases and TIMPs[M].New York: Oxford University Press,2002：91-96

[7]Nagase H, Visse R, Murphy G.Structure and function of matrixmetalloproteinases and TIMPs[J].Cardiovasc Res,2006,69(3):562-573

[8]Straat K,Klark R, Gredmark-Russ S,et al. Infection with Human Cytomegalovirus Alters the MMP-9/TIMP-1 Balance in Human Macrophages[J]. J Virol,2009, 83(2):830-835

[9]Feldman AM, Li YY,Mc Tlernan CF.Matrix metalloproteinases in pathohysiology and treatment of heart failure[J]. Lancet,2003,357:654-655

(收稿日期：2014-12-19)

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)01-0107-02

作者简介：迟男男(1982～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，医师。通讯作者：艾迎春(1960～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E-mail:48399233@qq.com。