大鼠急性胰腺炎的免疫变化与Treg及IL-35表达的相关性①

由昭阳，杨　沙，田　桦，卓　越

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)



大鼠急性胰腺炎的免疫变化与Treg及IL-35表达的相关性①

由昭阳，杨沙，田桦，卓越

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的：探讨Treg及IL-35在大鼠急性胰腺炎模型中的变化及意义。方法：36只S-D大鼠分为正常组(6只)和AP组(30只)，后者结扎胆总管造模成功后分别在2、6、12、24、48h处死，每次6只大鼠。流式细胞仪测定外周血中CD4+CD25+T细胞占淋巴细胞的百分比，ELISA法测定血IL-35水平。胰腺损伤程度根据参照吴建新[6]等的方法进行病理评分。结果：与对照组[(2.70±0.13)%]相比，AP各组Treg的比例在2、6，12、24、48h时明显下降(P<0.05)。IL-35水平在2、6、12、24、48h明显下降，与对照组(1.04±0.12pg/mL)相比,各组有统计学意义(P<0.05)。相关性分析提示Treg百分比与IL-35水平呈明显正相关。结论：大鼠急性胰腺炎模型调节性T细胞与IL-35水平均呈下降趋势。

关键词：急性胰腺炎;免疫变化;Treg;IL-35

研究显示AP病程中往往呈现免疫应激与免疫抑制先后并存、交替失衡的病理生理改变。有学者发现AP时外周血CD3+、CD4+T细胞数目及CD4+/CD8+比值下降，同时产生多种炎性介质及细胞因子引起机体免疫系统失衡，进而感染增加，多器官脏器衰竭[1]。而免疫系统自身又具有一定的自我调节功能，Treg就是具有负向免疫调控作用的淋巴细胞亚群[2,3]。IL-35也可以直接或间接地发挥免疫抑制作用[4]。本实验通过建立大鼠急性胰腺炎模型，行胰腺病理学评分，检测外周血Treg百分比及IL-35水平，初步探讨急性胰腺炎早期大鼠Treg及IL-35的变化及可能作用。

1材料与方法

1.1实验动物

S-D大鼠(n=36), 成年雄性，平均体重200g，佳木斯大学动物实验中心提供。

1.2实验主要试剂及仪器

LX-200掌式离心机(海门市麒麟仪器厂),流式细胞分析仪 FACScalibur(美国BD公司)，CD4抗体、CD25抗体(金山桥公司)，大鼠白细胞介素35ELISA试剂盒(上海诺源公司),-80℃度超低温冰箱(日本Sanyo 公司),YBL-2 生物组织包埋机,HM-315 组织切片机。

1.3动物实验模型制备与标本采集

1.3.1模型制备

本实验采用胆总管末端结扎法制备急性胰腺炎模型[5]，大鼠随机分为对照组(6只)及AP组(30只),其中AP组在造模后2、6、12、24、48h处死，每次处死6只大鼠。方法：两组实验动物均在同等条件下给予正常饲料和高温灭菌自来水喂养，4周后，平均体重200g，实验前禁食12h(正常饮水),将水合氯醛等比稀释后，向大鼠腹腔注射麻醉。将麻醉后的大鼠固定于手术台上。皮肤消毒，沿腹正中线切开直至腹部肌层，进入腹腔，将皮肤及肌层牵向两侧。寻找大鼠的胃，沿胃下端十二指肠端寻找十二指肠大乳头及胆总管末端，游离胆总管末端，用细线在胆总管末端结扎，关腹。正常组，正常饮食及饮水。根据胰腺水肿，白细胞浸润、出血和坏死程度病理评分，参照吴建新[6]等的方法评定造模是否成功。

1.3.2标本收集

造模成功后的2h、6h、12h、24h、48h时大鼠下腔静脉采血5mL存于真空抗凝管中3000r/min离心15min。取上清液置于-80℃冻存。取胰腺组织，在福尔马林溶液中固定48h后常规石蜡包埋。对照组采用同样方式处理。

1.4观察指标

1.4.1胰腺组织病理形态学观察及评分

取胰腺组织置于福尔马林中固定，经过脱水、石蜡包埋透明和封片后，用苏木素-伊红染色，观察胰腺病理改变。由佳木斯大学病理教研室病理医师观察切片。胰腺组织病理评分参照吴建新[6]等的方法。

1.4.2Treg百分比及IL-35水平测定

全血标本在肝素抗凝下经稀释、破红、洗涤及淋巴细胞分离后分别加CD4抗体和CD25抗体(中山金桥公司)，在试管中混匀，避光孵育20min后，将试管放入流式细胞仪，上机测定，CD4+CD25+的细胞为Treg，以均数±标准差表示。

IL-35测定采用标准酶联免疫吸附试验，抗体由上海诺源公司提供。按照试剂盒说明书执行。

1．5统计学方法

采用SPSS17.0统计软件，统计学分析将得到的数据进行转换，统计检验结果表明其转换值服从正态分布，利用方差分析进行组间比较；相关性分析采用Pearson相关分析法，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

血Treg及IL-35变化及其与病理评分相关性血Treg变化：各组Treg百分比平均水平在对照组为2.706%，而在AP各组均小于2%，在诱导AP后2 h时平均为1.735%，随着时间推移，Treg水平有下降趋势，到48 h达最低即0.744%。而统计结果显示AP各组Treg水平均较对照组显著降低(P<0.05)，见表1。Il-35变化：对照组为(1.04±0.12)pg/mL实验组2h(0.74±0.17)pg/mL，之后为下降趋势，直至48h最低值(0.31±0.11)pg/mL且P<0.05,见表1。

病理评分：通过肉眼观及光镜下观察，2h时最小值为3.23,至48h最大值为15.06，总体呈上升趋势。外周血Treg与IL-35呈正相关(Pearson相关性=0.398, P<0.05),两者与胰腺病理评分均呈负相关(Pearson相关性=-0.869及-0.407, P均<0.05)。

表1　外周血Treg、IL-35水平及胰腺病理

注：与对照组相比，#P<0.05,*P<0.05,^P<0.05。

3讨论

AP的发病是由多种机制共同作用的结果，其中免疫平衡失调占有重要地位。本实验结果显示，实验组中Treg呈逐渐降低(P<0.05),相关性分析提示Treg对急性胰腺炎有显著影响。既往研究表明，CD4+CD25+Treg细胞是具有免疫抑制作用的负向调控细胞，其免疫抑制作用有多种方式，其中最重要的方式是IL-2夺获[7]。IL-2作用于T淋巴细胞，使其增殖，而Treg上的CD25为IL-2受体α链，能与效应细胞竞争结合IL-2，Treg细胞消耗IL-2,导致IL-2这种细胞因子增殖缓慢，抑制了T细胞的迅速增长，由于在急性胰腺炎的初始阶段应为促炎反应占主导优势，随着疾病的发展，由促炎转变为抗炎，进而抑制免疫反应，抑制IL-2的力度是逐渐降低的，相对应的，T淋巴细胞的激活程度是逐渐升高的。这正与本实验Treg在实验组2h中所占淋巴细胞百分比最多，而随着时间的推移，Treg所占百分比是下降的趋势这一结果相符合。由此推测Treg所占百分比降低可能是急性胰腺炎早期免疫过度激活的机制之一。这与丁震[8]等研究结果类似。但丁震等研究中Treg在6小时后出现显著降低，这较迟于本实验的下降时间，考虑系本实验选取结扎胆总管的造模方式有关。

实验中发现随着大鼠急性胰腺炎的进展IL-35的含量是呈下降趋势的(P<0.05),同时胰腺病理评分逐渐增高，相关性分析提示IL-35对急性胰腺炎有影响(P<0.05)。这也符合我们现阶段对IL-35的认识，有研究表明IL-35可通过抑制淋巴细胞增殖作用降低炎性细胞因子的表达[9，10]，表明其在炎症过程中可能具有负向调节作用,另外，另一种由外周CD4+CD25+Treg细胞激活形成的iTreg细胞可分泌IL-35，而IL-35反过来对iTreg有正反馈作用[2]。在急性胰腺炎前期机体对于炎症的保护性反馈作用；至后期，机体释放出大量的致炎性细胞因子，抑炎性细胞因子的表达受到抑制，故IL-35的表达水平出现明显降低。

综上所述，血清IL-35 和外周血Treg百分比在大鼠急性胰腺炎模型不同阶段存在差异，可能在急性胰腺炎发生、发展过程中发挥重要作用。大鼠急性胰腺炎IL-35 和Treg 细胞亚群的检测，更能使我们正确、充分、全面地了解急性胰腺炎的发病机制和免疫变化，从而更有效地指导临床治疗。

参考文献：

[1]Kylnp ML,Repo H,Puolakkainen PA.Inflammation and immunosuppression in severe acute pancreatitis[J].World J Gastnoenterol,2010,16(23):2876-2872

[2]Collison LW,Chaturedi V,Henderson AL,et al.IL-35-mediated induction of a potent regulatory T cell population[J].Nat Immunol,2010,11(12):1093-1101

[3]Sakaguchi.Regulatory T cells:history and perspective[J].Methods Mol Bid,2011,707:3-17

[4]罗程,吉庆伟,林英忠.白介素-35的结构及其与疾病关系研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志，2012,28(7):769-770

[5]汤海涛,邢雪. 急性胰腺炎实验动物模型的建立方法及研究进展[J].中国现代普通外科进展，2014,17(5):412-414

[6]吴建新,袁耀宗,徐家裕,等. 大鼠急性坏死型胰腺炎病理特征评定方法的研究[J].中国实验动物学,2002,10(4):210-212

[7]Buckner JH.Mwchanisms of impaired regulation by CD4+CD25+FOCP3+regulatory T cells in human autommune diswases[J].Nat Rev Immunol,2010,10:849-859

[8]丁震,蔺蓉,钱伟,等.CD4+CD25+细胞与大鼠坏死性胰腺炎发病初期的免疫变化[J].中华消化杂志，2007,27(9):585-587

[9]Collison LW,Workman CJ,Kuo TT,et al.The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T cell function[J].Nature,2007,450(7169):566-569

[10]Liu F,Tong F,He Y,et al.Detectable expression lf IL-35 in CD4+T cells from peripheral blood of chronic hepatitis B patients[J].Clin Immunol,2011,139(1):1-5

(收稿日期：2015-11-21)

中图分类号：R576

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)01-0037-02

(作者简介：由昭阳(1988～)女，黑龙江七台河人，在读硕士研究生。(通讯作者：田桦(1969～)女，黑龙江佳木斯人，双学士,副主任药师，硕士研究生导师。E-mail:zhuoyuejsmu@126.com。

基金项目:1.佳木斯大学研究生创新科技课题，编号:LM2015_025;2.黑龙江省自然科学基金面上项目，编号：H2015072。