PU.1在肺纤维化大鼠中的作用①

鲍文华，王　瑾，李树民，杨晓东，马雪梅，孙云晖

(佳木斯大学附属第一医院呼吸内科,黑龙江 佳木斯 154003)



PU.1在肺纤维化大鼠中的作用①

鲍文华，王瑾，李树民，杨晓东，马雪梅，孙云晖

(佳木斯大学附属第一医院呼吸内科,黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的:探讨博来霉素所致肺纤维化大鼠中PU.1的表达水平，探究地塞米松对肺纤维化的作用机制。方法:将30只SPF级SD大鼠按照随机数字表法分为健康对照组(N)，模型组(B)，地塞米松治疗组(D)，每组10只。每组大鼠分别在第28天处死。气管内注射博莱霉素制作肺纤维化模型。采用实时荧光PCR检测肺泡灌洗液(BALF)PU.1mRNA的含量。结果:(1)模型组肺泡灌洗液PU.1mRNA含量明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。(2)地塞米松治疗组PU.1mRNA含量较模型组明显减低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论:转录因子PU.1在肺纤维化中起作用，地塞米松可能通过下调PU.1的表达抗肺纤维化。

关键词：肺纤维化；转录因子；PU.1；地塞米松

肺纤维化是间质性肺炎中最常见类型，预后较差。炎症细胞、免疫细胞、肺泡上皮细胞、成纤维细胞及其分泌的介质和细胞因子，在引起肺间质纤维化的发病上起重要作用。富含嘌呤盒1(purine-rich box 1，PU.1)是E26(E-twenty six，ETS)转录因子家族成员，是造血干细胞增殖和分化的主要调节因子，维持机体细胞稳态，对机体炎症及免疫起重要作用。本实验，我们观察肺间质纤维化大鼠PU.1的表达量，旨在探讨转录因子PU.1在肺纤维化中的作用及地塞米松抑制肺纤维化的作用机制。

1材料与方法

1.1材料

博莱霉素购自美国Invitrogen公司，Trizol试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒由哈尔滨HaiGene公司提供。离心机为上海安亭公司产品、光学显微镜为奥林巴斯公司产品、PCR仪为Bio-Rad Min-Opticon2。

1.2方法

①模型建立：30只SPF级SD大鼠(佳木斯大学动物实验中心提供)，6~8周龄，体重200~230g，按随机数字表法分为三组：健康对照组(N)、模型组(B)、地塞米松治疗组(D)，BLM组处理方案参照文献[1]并在此方案上改进，采用气管内注入博莱霉素制作肺纤维化模型，地塞米松治疗组在肺纤维化模型基础上第8天将3mg/kg地塞米松腹腔注入，健康对照组用生理盐水替代博莱霉素，持续到第28天后处死。

②BALF的收集：以10%水合氯醛极量腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位于鼠板上，切开胸部，暴露气管和主支气管，结扎右主支气管，用14号针头插入气管中，结扎，经气管注入生理盐水2mL，抽吸混匀，反复灌洗三次，共收集肺泡灌洗液4mL，1500r/min,离心15min，上清-80℃保存。

③肺组织标本的留取：暴露气管与双肺，分离肺组织，用止血钳夹闭右肺门并结扎，立即取下右肺，PBS冲洗肺脏表面，用滤纸拭干，将肺组织给予4%多聚甲醛固定24h，常规石蜡包埋、切片，用于HE染色。

④PU.1mRNA测定：离心处理BALF，留取沉淀，采用Trizol法抽提RNA，逆转录为cDNA，实时荧光PCR检测PU.1mRNA表达水平，引物序列为PU.1：5’- TGCTTCCCTTATCCACCCTTG-3’(上游)5’- TCTTCTTGCTGCCTGTCTCC-3’(下游)；GAPDH：5’-AACTCCCATTCTTCCACCTTT-3’(上游)5’-CTCTTGCTCTCAGTATCCTTG-3’(下游)。

1.3统计学方法

2结果

2.1肺组织形态学观察

光学显微镜镜下观察N组肺组织结构正常，无纤维化改变。B组与N比较肺组织出现明显纤维化改变，肺泡结构破坏，肺泡间隔明显增宽，纤维沉积明显，肺组织呈广泛纤维化改变。D组与B组比较肺组织纤维化程度明显减轻，肺泡间隔增厚减轻。依据Szapiel方法进行肺纤维化评分：0级:无纤维化；I级:病变范围占全非20%以下；II级:病变范围占全肺的20%～50%；III级:病变范围超过全肺50%。与健康对照组比较，模型组和地塞米松治疗组肺纤维化评分明显增高；与肺纤维化组比较，地塞米松组肺纤维化评分降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1 。

表1　大鼠肺组织纤维化评分

注：与对照组比较，▲P<0.05;与肺纤维化组比较，#P<0.05。

2.2大鼠肺泡灌洗液PU.1mRNA含量比较

采用实时荧光PCR方法检测大鼠肺泡灌洗液PU.1mRNA表达量，健康对按照组、模型组、地塞米松治疗组PU.1mRNA含量分别为0.901±0.137、1.051±0.126、0.886±0.171，与健康对照组比较，模型组PU.1mRNA含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)地塞米松治疗组较健康对照组无明显变化(P>0.05)；与模型组比较，地塞米松治疗组PU.1mRNA含量明显减低，差异有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

肺纤维化(PF)系间质性肺炎中的一种，病变局限于肺部，引起弥漫性肺纤维化，导致肺功能损害和呼吸困难等症状。PF无明确流行病学资料，近年来临床诊断的病例有增加趋势，且死亡率高，5年生存率为70%，中位生存期为3年或出现症状后5年，目前肺纤维化目前尚无有效治疗手段，预后差[2]。肺纤维化病因及机制尚不甚明了，损伤的肺泡上皮细胞、单核-巨噬细胞和淋巴细胞浸润及其分泌的炎症介质促进肺纤维化的发生发展，成纤维细胞增殖、细胞外基质质沉积，最终导致肺纤维化的形成。已有文献表明，转录因子PU.1有助于造血干细胞向巨噬细胞方向和淋巴细胞方向正常增殖和分化，促进粒细胞炎症趋化，同时调节炎症相关细胞因子及受体[3]。所以，PU.1干预肺纤维化过程中多种细胞和因子的表达及作用。 目前肺纤维化亦无明显有效治疗手段，虽然推荐新药吡非尼酮的应用，但因广泛不良反应和价格昂贵，应用受限[4]。糖皮质激素作为抗肺纤维化药物存在诸多争议，根据最新指南，泼尼松、硫唑嘌呤、NAC三联疗法仅用于IPF患者[5]。

地塞米松作为糖皮质激素，通常认为其抗纤维化作用与抑制中性粒细胞、淋巴细胞浸润，抑制巨噬细胞增殖和分泌等有关[6,7]。

本研究结果表明，大鼠肺泡灌洗液中PU.1mRNA的表达含量模型组明显高于健康对照组，表明PU.1可以促进肺纤维化的形成。与模型组组比较，地塞米松组PU.1mRNA含量明显减低，差异有统计学意义，且大鼠肺纤维化经过地塞米松治疗后PU.1含量接近健康对照组，两者无明显差异，说明地塞米松起到一定抗纤维化作用。转录因子PU.1及地塞米松在肺纤维化中的作用均与炎症细胞及免疫细胞有关，故而猜想地塞米松可能通过抑制PU.1起到抗肺纤维化的作用。肺纤维化的发病机制和治疗均尚不明确，本研究结果初步显示转录因子PU.1在大鼠肺纤维化中起作用，地塞米松可能通过抑制PU.1的表达含量起到抗纤维化的作用。具体将在后续研究中进一步探讨。

参考文献:

[1]Syrbu S, Thrall RS, Smilowitz HM. Sequential appearance of inflammatory mediators in rat bronchoalveolar lavage fluid after oleic acid-induced lung injury[J].Exp Lung Res,1996,22(1):33-49

[2]Subodh V，Arthur S． Idiopathic pulmonary fibrosis— new insights[J]．New Engl J Med，2007，13:1370-1372

[3]王权，孙文逵，施毅.转录因子PU．1与机体免疫功能的相关性及其研究进展[J].J Med Postgra，2013, 26(10)：1096-1100

[4]胡艳秋，于连，胡俊华，等.肺靶向吡非尼酮脂质体的制备及体外释药性质研究[J].黑龙江医药科学,2012,35(3)：69

[5]An afficial ATS/ERS/JRS/ALAT clinical practice guide-line：Treatment of Idiopathic pulmonary fibrosis[J]. American Journal of Respiratory and Clinical Care Medicine，2015，2(192):3-19

[6]Li H P，Li X，He G J，et al． The influence of dexamethasone on the proliferation and apoptosis of pulmonary inflammatory cells in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J]．Respirology，2004，9(1):25-32

[7]Chen F，Gong L，Zhang L，et al． Short courses of low dose dexamethasone delay bleomycin-induced lung fibrosis in rats[J]．Eur J Pharmacol，2006，536(3):287-295

(收稿日期:2015-11-20)

中图分类号：R563

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)01-0015-02

作者简介：鲍文华(1962～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，硕士研究生导师。

基金项目：1.黑龙江省自然科学基金项目，编号：H201370；2.佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：LM2015_033。