异戊烯焦磷酸扩增成人外周血以及脐带血γδT细胞效能比较

任树华，冯　玲，喻梅星，柳　怡，颜　焰，杨　凡

(1.成都市锦江区妇幼保健院产科，四川 成都　610021；

2.四川大学华西第二医院儿科，四川 成都　610041；

3.四川大学华西第二医院-香港大学医学院医学联合研究中心，四川 成都　610041)



异戊烯焦磷酸扩增成人外周血以及脐带血γδT细胞效能比较

任树华1，冯玲2，喻梅星3，柳怡1，颜焰1，杨凡2

(1.成都市锦江区妇幼保健院产科，四川 成都610021；

2.四川大学华西第二医院儿科，四川 成都610041；

3.四川大学华西第二医院-香港大学医学院医学联合研究中心，四川 成都610041)

[摘要]目的：研究异戊烯焦磷酸(IPP)扩增成人外周血以及脐带血γδT细胞效能比较。方法：梯度离心法分离成人外周血以及脐带血淋巴细胞，分别加入IL-2和IPP，在10%小牛血清的RPMI-1640培养体系下，刺激培养不同时间，用流式细胞仪检测2种标本被刺激后γδT细胞增殖比例。结果：IL-2加IPP扩增后成人外周血γδT细胞在淋巴细胞中比例上升为73.05%±2.92%；脐带血组扩增后γδT细胞在淋巴细胞中比例上升为38.66%±5.14%；不同来源的γδT细胞的在相同质量分数和时间刺激下扩增的效率有显著性差异。相同的扩增条件下，成人γδT细胞增殖峰值在第14天，而足月儿的扩增峰值延迟到第18天。结论：脐带血来源的γδT细胞对IPP抗原刺激反应较弱，可能是新生儿早期天然免疫力低下的原因之一。

[关键词]γδT细胞；异戊烯焦磷酸；新生儿；脐带；血液

近年来报道，感染是新生儿致死的主要原因之一，而低下的免疫功能是新生儿易患高致死性感染性疾病的主要原因[1]。对于新生儿而言，其抗原提成细胞(DC细胞等)的不成熟以及孕期Th1主导的免疫环境一直延续到出生后数月将会抑制适应性免疫应答[2]。因此天然免疫功能对于新生儿至关重要。

γδT细胞是近年来发现的一种新型天然免疫细胞，它不同于传统的αβT细胞，而是拥有γδ链的天然免疫细胞。γδT细胞不仅有高效的抗病毒和吞噬等典型的天然免疫功能，同时还可以作为特殊APC细胞进一步活化适应性免疫应答[3]。虽然γδT细胞有强大的横跨天然和适应性免疫应答的功能，但是γδ在成人外周血中的数量仅有2%～12%，而在脐带血中的比例更少。数量少成为制约其发挥功能的主要问题。如何在急性感染侵袭时产生大量的γδT细胞发挥免疫作用已经成为亟需解决的问题。有报道发现IPP抗原能与γδ细胞的TCR受体结合从而刺激γδT细胞的大量增殖，但是对于脐带血来源的γδ细胞目前研究甚少。本试验致力于比较IPP对于成人外周血和脐带血来源的γδT细胞的扩增效能，从而提供IPP用于高效扩增脐带血γδT 细胞临床应用的初期试验依据。

1对象与方法

1.1标本的采集和PBMC的制备2011—2012年来自成都血液中心新鲜成人外周血4例，每例400 mL，经过分离处理后得到血液白膜层15 mL。白膜层加入PBS稀释，经过Ficoll-Hypaque分离白膜层，400 G，10 min梯度离心得到PBMC8×107细胞/例。2012年来自锦江区妇幼保健院产科正常新鲜足月儿脐带血4例，每例100 mL，处理同前。

1.2IPP刺激作用使用10%小牛血清的RPMI-1640培养基中加入9 μg/mL的IPP。同时从培养第3天开始每隔3 d加入IL-2使之最终质量分数为500 U/mL。分配PBMCs在24孔板中，每孔细胞密度为1×106个细胞。培养于37 ℃、5%CO2饱和湿环境中培养箱中。

1.3流式测定细胞数目培养第0 天，和第6～20天，每隔2～4 d收集1孔。PBMCs表面染色anti- human CD3(PB-BD)，anti-human TCR Vδ2 (PE-BD)。使用Gallios (Beckman Coulter) 流式细胞仪器测定，并用FlowJo (version 7.6.5，Tree Star)流式分析软件分析。

1.4统计学分析对于脐带血γδT细胞和成人外周血γδT细胞扩增的组间比较使用t检验，对于不同时间点扩增倍率比较采用重复测量的t检验。

2结果

2.1γδT 细胞扩增比率的测定结果详见表1。

经过IPP加IL-2的扩增后，选取最高扩增比率得到结论：成人组为73.05%±2.92%，脐带血组为38.66%±5.14%，二者比较有显著性差异(P<0.05)。

表1　扩增率比较

2.2γδT 细胞不同时间点增殖倍数测定IPP加IL-2扩增γδT 细胞后，从第6天开始到第20天，每2～4 d检测增殖倍数。脐带血来源的γδT 细胞增殖倍数的高峰在第18天，而成人外周血来源的γδT 细胞增殖倍数高峰在第14天

3讨论

围生期的死亡因素中，严重的感染一直居高不下。近年来国内外的研究主要集中于新生儿适应性免疫应答和抗原提成细胞的成熟度，少有关于天然免疫反应能力的报道。新生儿时期免疫系统并未完全发育成熟，其功能与儿童及成人有较大差别。在生后初期，由于T细胞和B细胞的功能较多依赖于时间和抗原的刺激，因此适应性免疫应答在围生期的发挥抗感染能力非常有限[4]。因此天然免疫在新生儿生后早期有至关重要的作用。

γδT细胞作为新近研究的天然免疫细胞，主要分布于外周血和淋巴器官中，主要的人类的γδT细胞以Vγ9Vδ2T细胞为主。Vγ9Vδ2T细胞是不受MHC分子限制作用的，通过isoprenoid biosynthesis 通路代谢。IPP可以通过macalonate 通路选择性地活化γδT细胞。

但是国内外针对外周血的研究报道，γδT细胞在外周血PBMC中的比例2%～12%不等，我们选取的正常成人所测的比例在2.35%～6.84%之间，符合目前文献报道。而我们的实验结果发现，脐带血中的γδT细胞在1.25%～2.15%之间，与之前的报道类似。如何有效地提高γδT细胞数目，目前国内外主要有IPP方法扩增，但是尚无人比较2种人类主要来源的γδT细胞的增殖效果以及增殖反应的最佳时间。我们的结果提示，以IL-2作为淋巴细胞生长的维持因子，有一定的辅助增殖作用；没有IL2的扩增条件下，即使有高效的刺激因子，γδT细胞扩增仍然不明显。进一步的试验证实，扩增刺激剂在IL-2的辅助作用下，在不同的来源γδT细胞体系中有不同的扩增效率，成人γδT细胞对于IPP抗原刺激的反应明显高于脐带血来源的γδT细胞。

时间梯度扩增试验发现，对于成人γδT细胞第14天的扩增时间最佳，但是对于脐带血γδT细胞而言第18天的扩增效果最佳。试验推测，因为IPP是直接作用的macalonate通路选择性的活化γδT细胞，而脐带血的γδT细胞的TCR受体的发育并不完善，并且数量较少，因此即使相同质量分数的IPP依然无法高效地引起增殖反应。

无论是脐带血来源的γδT细胞还是成人外周血γδT细胞，在IPP加IL-2的辅助下经过适当的培养刺激时候之后，均能有效地进行扩增，但是脐带血的扩增效能较低。我们的试验结论为新生儿在遭遇急性感染时候，早期及时地扩增γδT细胞，提供高效的天然免疫能力， 及时启动适应性免疫应答提供新的方法思路。

参考文献：

[1]何振娟，陈同辛，吴圣楣，等．PMA和IM诱导的新生儿脐带血淋巴细胞增殖反应[J]．新生儿科杂志，2000，15(4)：152-154, 191-192．

[2]郝丽，郑成中．新生儿感染T淋巴细胞亚群及细胞因子变化分析[J]．临床儿科杂志，2014，32(9)：825-828．

[3]胡朝英，钱柳，程伟志，等．γδ T细胞诱导与分化的初步研究-Ⅰ[J]．中国免疫学杂志，2010，26(4)：368-371．

[4]刘敬．脐血免疫功能研究进展[J]．中华围产医学杂志，2001(4)：65-66．

(收稿日期：2015-10-21)

[中图分类号]R722

[文献标识码]A

DOI:10.11851/j.issn.1673-1557.2016.02.016

通信作者：任树华，2359751116@qq.com

优先数字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20151228.1653.016.html