130例β-地中海贫血基因突变类型分析

何琳琳

(荆门市第一人民医院，湖北 荆门　448000)



130例β-地中海贫血基因突变类型分析

何琳琳

(荆门市第一人民医院，湖北 荆门448000)

[摘要]目的：研究分析β-地中海贫血基因突变类型。方法：以2012年4月至2015年1月来我院诊治的130例携带β-地中海贫血基因患者作为研究对象，采取聚合酶链反应以及反向点杂交技术对患者实施基因分型，观察分析β-地中海贫血患者基因突变情况。结果：130例携带β-地中海贫血基因者中，大部分为婴儿和青少年，有100例为杂合子，6例为纯合子，24例为双重杂合子。突变基因中以TVS-2-654和CD41～42最为常见。结论：β-地中海贫血基因突变类型比较复杂，同时遗传异质性较为显著，在今后地中海贫血遗传咨询以及产前诊断时，应加强该基因突变类型的检测以及筛查，从而为优生优育提供更为合理且全面的指导。

[关键词]突变；β-地中海贫血；基因

所谓β-地中海贫血是指β链合成完全被抑制或者部分受抑制的血红蛋白疾病，多发于婴儿期，其中出生后3～6个月发病者所占比例占1/2。据调查，该病发病年龄越早则患者病情越严重，需依靠定期输血维持生命[1-2]。在β-地中海贫血临床诊断中可结合患者临床症状表现与血液检查确诊。目前在β-地中海贫血临床中尚无有效治疗方法，因此加强产前基因和携带β-地中海贫血基因者的筛查、检查诊断成为目前提升人口素质的有效措施之一[3]。本次研究就本地区携带β-地中海贫血基因者基因突变类型进行研究分析。

1资料和方法

1.1一般资料本次研究血样来源于2012年4月至2015年1月到本院予以诊治的130例携带β-地中海贫血基因患者，血样间没有亲缘关系。患者中：男70例，女60例；年龄20天至64岁。所有患者或其家属签署知情同意书。

1.2主要仪器及试剂血细胞自动分析仪(XS-800i，由日本希美康公司生产)、PCR仪(由德国Eppendorf公司生产)、ABI30130程序仪(由美国Applied Biosystems公司生产)、高效液相色谱仪(由美国BIO-RAD生产)、DNA快速提取试剂盒、胶回收试剂盒、β-地中海贫血基因检测试剂盒以及Taq酶，其中DNA快速提取试剂盒和β-地中海贫血基因检测试剂盒由深圳益生堂生物企业有限公司生产，胶回收试剂盒由德国Qiagen公司生产，Taq酶由大连TaKaRa公司生产。

1.3方法采集血样的时候，对所选对象祖籍和婚姻情况进行考证。采集静脉血，利用乙二胺四乙酸实施抗凝，且利用DNA快速提取试剂盒进行DNA基因的提取，严格按照说明书和操作流程执行。检查诊断主要包含以下2方面：(1)β-地中海贫血基因。采用RDB法(反向斑点杂交)根据试剂盒操作说明书进行操作，其中PCR反应体系，DNA模板为3 μL，总体积为50 μL，Tap酶为2 μL，含有PCR混合液45 μL。反应条件，94 ℃分别5 min和1 min，55 ℃为30 s，72 ℃分别为60 s和5 min，储存温度4 ℃。利用2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，查看是否存在特征性条带。PCR产物经杂交膜条斑点显色明确基因型，其中正常斑点完全显色同时未发生异常突变的斑点一同显色表示正常基因型，若突变斑点和其相应的正常斑点一同显色则表示基因突变型。(2)罕见β-地中海贫血基因。对于没有检测出常见β-地中海贫血突变血样，对β-珠蛋白基因全长进行扩增。β-珠蛋白引物为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其中PCR反应体系，DNA模板为2 μL，总体积为50 μL，Tap酶为0.5 μL，无菌蒸馏水为36.5 μL，引物为1 μL,含有10×PCR buffer 5 μL。反应条件，95 ℃分别5 min与1 min，55 ℃为30 s，而72 ℃分别为90 s和10 min，储存温度为4 ℃。利用1%琼脂糖凝胶PCR产物进行电泳，查看是否存在目的条带。对于没有检测出常见β-地中海贫血突变的血样，经PCR扩增以及纯化以后直接测序，将扩增β-珠蛋白基因全长引物作为测序引物，将提纯PCR产物当作模板，借助于DNA全自动序列分析仪实施序列测定，接着基于两端测出序列。而后设中间段测序引物，并再次实施测序反应，以获得β-珠蛋白基因者整个全长序列。

1.4统计学方法利用Excel录入整理研究数据，并用SPSS17.0软件对数据予以统计学处理和分析。根据本次研究需求，采取描述性法，分析β-地中海贫血基因突变。

2结果

130例携带β-地中海贫血基因者中，年龄在20 d至1岁的有60例，年龄在2～18岁的有40例，超过18岁的有30例。携带β-地中海贫血基因者中有100例为杂合子，占76.9%；6例为纯合子，占4.6%；24例为双重杂合子，占18.5%。经比较分析，杂合子基因突变所占比重和纯合子、双重杂合子相比较明显要高(P<0.05)。β-地中海基因突变类型频率分布与表型如表1所示。

表1　β-地中海基因突变类型频率分布与表型

注：β0为β珠蛋白肽链合成缺失；—表示没有证实；β+为β珠蛋白肽链合成减少

经过表1数据的分析可知，IVS-2-465和CD41～42出现频率为最高，其次是CD17、-28，其中IVS-2-465、CD41～42和其他基因突变出现频率相比较有显著性差异(P<0.05)。经DNA测序，由于β-基因外显子2-的36位编码氨基酸缺失一个碱基C，造成蛋白质翻译终止于第60位，因此出现了一种新基因突变，即CD36。

3讨论

在临床中，β-地中海贫血属于遗传性溶血性贫血疾病，该病多发于婴儿期，症状表现不明显，随着年龄的增长，骨骼会发生变化，出现眼距增宽、特殊面容(头大、鼻梁低陷、额部突起以及两颧略高)、眼睑水肿、生长发育停滞、皮肤斑状色素沉着、肝脾大以及食欲不振等现象，大部分患者在5岁之前死亡[4]。经研究调查和文献报道分析认为β-地中海贫血主要是因β-珠蛋白基因存在缺陷所引起，且多为点突变，部分为缺失β-珠蛋白基因。有学者将基因缺失以及点突变造成β链生成全部受抑制的叫作β0-地中海贫血，将点突变以及基因缺失造成β链生成部分受抑制的叫作β+-地中海贫血[5]。据调查资料显示，全球大约有9 000万人携带该病基因，同时每年大约有20万双重杂合子或者纯合子基因型β-地中海贫血新生儿出生[6]。

本次研究选择130例携带β-地中海贫血基因患者作为研究对象，其中以婴儿和青少年占多数。就基因突变情况来看，杂合子患者表型主要为静止型，即携带者，能遗传给后代，对此，在预防以及控制β-地中海贫血时，需着重加强携带血的检测以及筛查。同时本次研究结果还表明，IVS-2-465和CD41～42突变频率较高，这2种突变类型比较常见，其中：IVS-2-465突变于内含子第654碱基出现C-T碱基置换，造成mRNA加工发生异常，使β珠蛋白翻译受影响；CD41～42突变于β基因41～42 密码子位置缺失碱基共4个，导致阅读框架发生变化，使终止密码提前出现，造成β珠蛋白链合成全部受抑制。对此，在β-地中海贫血疾病预防中，应着重预防IVS-2-465突变与CD41～42突变。除此之外，本次研究还发现有CD36突变，表明本地区β-地中海贫血基因突变比较多样，同时遗传异质性明显，从该结果来看，本地区β-地中海贫血基因多样性以及明显异质性具备自身特点。

综上所述，β-地中海基因突变类型非常多，在疾病控制以及预防过程中，应加强关于地中海贫血方面的知识宣教，加强产前诊断、人群筛查以及遗传咨询，降低该病重症患儿的出生，以此减轻家庭负担以及社会负担。除此之外，在今后β-地中海疾病的控制以及预防中，还应注意未知基因突变的检测以及筛查，获得更多有关基因多态性和基因突变遗传信息，阐明各种基因突变类型病理机理，以此为优生优育工作的开展提供相应的指导，继而进一步提升人口素质。

参考文献：

[1]BABAMETO L A,MITRE A,BERISHA S,et al.Molecular Genetic Characterization of β-Thalassemia and Sickle Cell Syndrome in the Albanian Population[J].Balkan J Med Genet,2011,14(1):45-50.

[2]李莉艳，李强，宋兰林，等.69例α β复合型地中海贫血的血液学和基因型研究[J].实用妇产科杂志，2011，27(5)：378-382.

[3]孙顺昌，周指明，宋慧文，等.轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血患者β-珠蛋白基因( AC)n(AT)x Ty多态性分析[J].中华检验医学杂志，2012，35(1)：32-36.

[4]李东明，胡雪桦，黄战，等.β-地中海贫血表型儿童地中海贫血基因突变分析[J].中国妇幼保健，2015，30(3)：370-372.

[5]刘贵建，孙士鹏.地中海贫血的实验诊断:项目和方法的选择及临床应用评价[J].中华检验医学杂志，2012，35(5)：385-389.

[6]VYSSOULIS G, KARPANOU E, KYVELOU S M, et al. Ambulatory blood pressure profile in hypertensive patients with β-thalassemia minor[J]. Hypertens Res, 2011, 34(2): 253-256.

(收稿日期：2015-07-01)

[中图分类号]R556.6+1

[文献标识码]A

DOI:10.11851/j.issn.1673-1557.2016.02.013

优先数字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20160311.2002.002.html

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