人参皂苷Rg3联合索拉非尼对人肝癌细胞株侵袭与转移的影响

陆玲玲

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁　锦州　121000)



人参皂苷Rg3联合索拉非尼对人肝癌细胞株侵袭与转移的影响

陆玲玲

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121000)

〔摘要〕目的探讨人参皂苷Rg3联合索拉非尼对人肝癌细胞株侵袭与转移的影响。方法分别将人参皂甙Rg3和索拉非尼两种单药、两药联合方式作用于人肝癌细胞，观察其对细胞侵袭和转移的影响。结果作用1 h，索拉非尼组黏附抑制率显著高于人参皂苷Rg3组(P<0.05或<0.01)，联合组显著高于索拉非尼组和人参皂苷Rg3组(P<0.01)；作用2 h，人参皂苷Rg3组抑制率显著高于索拉非尼组(P<0.01)，并且高于人参皂苷Rg3组作用1 h(P<0.01)；两药联合对肝癌细胞的黏附抑制率具有协同作用(Q=2.63>1.15)。索拉非尼单药及索拉非尼联合人参皂苷Rg3对肝癌细胞的迁移抑制率均显著高于人参皂苷Rg3单药作用(P<0.01)，并且两药联合的抑制率显著高于索拉非尼单药组(P<0.01)；两药联合对肝癌细胞的迁移抑制作用具有协同作用(Q=1.46>1.15)。索拉非尼组和联合组侵袭抑制率均显著高于人参皂苷Rg3组(P<0.01)，两药联合对肝癌细胞的侵袭抑制作用具有拮抗作用(Q=0.71<0.85)。与阴性对照组比较，人参皂苷Rg3组CD44V6、基质金属蛋白酶(MMP)-9表达水平显著下降，索拉非尼组和联合组血管内皮生长因子(VEGF)-C、CD44V6及MMP-9表达均显著下降(P<0.05)；与人参皂苷Rg3组比较，联合组VEGF-C及CD44V6水平显著下降；与索拉非尼组比较，联合组VEGF-C水平显著下降(P<0.05)。结论人参皂苷Rg3、索拉非尼单药及两药联合对肝癌细胞SMMC-7721细胞株的黏附、迁移、侵袭具有一定的抑制作用，对细胞的黏附和迁移抑制作用两者均具有协同作用。

〔关键词〕人参皂苷Rg3；索拉非尼；肝癌细胞；侵袭；转移

肿瘤的侵袭和转移过程复杂，黏附、降解、运动、新生血管形成等参与了肿瘤细胞的转移和侵袭。肝细胞癌是临床常见肿瘤，并且根治性切除后具有较高的复发率，而局部治疗的转移和复发率更高。人参皂苷Rg3对肿瘤细胞有抑制作用，可通过抑制肿瘤新血管生成抑制肿瘤细胞的侵袭、转移和复发〔1，2〕。索拉非尼是一种新型的多靶向抗癌药物，选择性作用于一些蛋白的受体，而这些蛋白受体在肿瘤细胞的生长过程中发挥分子开关样作用〔3，4〕。本研究主要研究人参皂苷Rg3联合索拉非尼对人肝癌细胞株侵袭与转移的影响。

1材料与方法

1.1材料及试剂试验细胞为人肝癌SMMC-7721细胞株，由上海细胞生物研究所提供。人参皂苷Rg3由上海抚生生物科技有限公司提供。索拉非尼(德国Bayer Schering pharma AG，批号：201304211)。培养基、胎牛血清由环凯微生物科技提供。CD44V6兔抗人多克隆抗体、血管内皮生长因子(VEGF)-C兔抗人多克隆抗体、基质金属蛋白酶(MMP)-9兔抗人多克隆抗体由上海紫域生物科技有限公司提供。CO2培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；自动酶标读数仪：深圳市爱康生物科技有限公司；高速冷冻离心机：北京时代北利离心机有限公司。

1.2细胞培养肝癌细胞株接种于培养瓶后，加培养液，放入37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱培养。覆盖瓶底的80%后开始传代，取对数生长期的细胞用于研究。

1.3分组方法根据作用药物的不同，分为人参皂苷Rg3组、索拉非尼组、联合组及阴性对照组。参考文献〔5〕选择药物浓度为对肝癌细胞株24 h增殖抑制率<15%，人参皂苷Rg3浓度7.5 μg/ml，索拉非尼浓度1.25 μmol/L。

1.4MTT比色法检测各组细胞黏附实验对数生长的肝癌细胞株接种于培养瓶中，细胞浓度3×104个/ml，培养瓶含等量的培养液。放置于培养箱内培养，培养条件37℃，5%CO2，24 h后根据设定的分组，加入相应的药物，阴性对照组加培养液。放置培养箱内培养24 h，培养条件37℃，5%CO2。包被基底膜，加入96孔板，每孔30 μl，4℃过夜，水化基地膜。消化药物处理后的接种细胞，培养液调整细胞密度为2×105个/ml，接种于包被基底膜的96孔板内，100 μl/孔，每组设5个复孔，结果取平均值。培养板置于培养箱内分别培养1和2 h，培养条件37℃，5%CO2。采用MTT比色法检测黏附情况。培养后1和2 h，弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，加20 μl的浓度为5 mg/ml的MTT，继续培养4 h，弃上清，加100 μl的盐酸异丙醇，混匀。在波长570 nm处读吸光度值。计算黏附抑制率=〔1-(实验组吸光度值-空白孔吸光度值)〕/(阴性对照组吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。

1.5Transwell小室实验检测各组细胞迁移情况采用Transwell小室实验计算各组迁移率。对数生长期细胞去除含有血清的培养液，换为无血清培养液培养12 h，调整细胞密度为1.0×105个/ml，取100 μl加入Transwell小室，加入对应的药物，对照组加培养液，均为100 μl，每组设5个复孔，结果取平均值。Transwell小室的下室加入含20%胎牛血清的培养液500 μl，放置于培养箱中培养24 h，培养条件37℃，5%CO2。24 h后取出，擦去未迁移的细胞，结晶紫染色，PBS冲洗。在显微镜下计数小室外底部细胞数，每个样本去3个视野取平均数为发生迁移的细胞数，计算迁移抑制率。迁移抑制率=〔1-(实验组穿膜细胞数/对照组的穿膜细胞数)〕×100%。

1.6Transwell小室实验检测各组细胞侵袭实验对数生长细胞去除含有血清的培养液，换为无血清培养液培养12 h。将融化稀释的Matrigel基质胶30 μl加入Transwell小室，37℃孵育2 h；取50 μl浓度为10 mg/L纤维连接蛋白溶液包被小室反面，风干。调整细胞密度为1×105个/ml，取100 μl加入小室，加相应的药物100 μl，对照组加培养液，每组设5个复孔。小室下室加含20%胎牛血清的培养液500 μl。培养24 h，培养条件37℃，5%CO2。取出小室，擦去上室未迁移细胞，风干，结晶紫染色，PBS冲洗。显微镜下计数细胞，每个样本取3个视野，计数侵袭细胞数，计算侵袭抑制率。抑制率=〔1-(实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数)〕×100%。

1.7采用免疫细胞化学法检测VEGF-C、CD44V6、MMP-9蛋白表达调整细胞密度为3×104个/ml。1.5 ml细胞悬液计入6孔板，培养24 h，培养条件37℃，5%CO2。加对应药物1.5 ml，对照组加培养液1.5 ml，培养48 h，培养条件37℃，5%CO2。弃上清，固定细胞，将细胞爬片加PBS覆盖，15 min后PBS冲洗3次，加0.1%的triton-100，放置15 min，PBS浸泡5 min，冲洗3次，加3%H2O2-甲醇溶液浸泡10 min，PBS冲洗3次，加一抗，4℃过夜，PBS冲洗3次，加增强剂孵育20 min，PBS冲洗3次，加二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，DAB显色。染色成功后终止染色。加苏木素复染30 min，蒸馏水冲洗，封片。CD44V6定位于细胞膜上，呈棕黄色，也可见细胞质内，MMP-9和VEGF-C定位于细胞质，呈棕黄色。在200倍视野下取细胞分布均匀视野10个，根据着色强度计分：无0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕色3分。计算HSCORE得分。HSCORE=∑Pi(i+1)，i为计分，Pi为得分为i的比例。

1.8两药联合作用判断Q=联合抑制率/〔人参皂苷Rg3单药抑制率+(1-人参皂苷Rg3单药抑制率)×索拉非尼单药抑制率〕，Q>1.15为协同作用，<0.85为相互拮抗作用，0.85~1.15为相加作用。

1.9统计学方法采用SPSS15.0统计学软件进行F检验，t检验。

2结果

2.1各组黏附抑制率比较作用1 h，索拉非尼组黏附抑制率显著高于人参皂苷Rg3组(P<0.05)，联合组显著高于索拉非尼组和人参皂苷Rg3组(P<0.01)；作用2 h，人参皂苷Rg3组抑制率显著高于索拉非尼组(P<0.01)；并且高于人参皂苷Rg3组作用1 h(P<0.01)。见表1。两种药物联合作用1 h Q=2.63，>1.15，说明两药联合对肝癌细胞的黏附抑制率具有协同作用。

表1　各组黏附抑制率、迁移抑制率、侵袭抑制率比较±s)

与人参皂苷Rg3组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与索拉非尼组比较：3)P<0.05

2.2各组迁移抑制率比较索拉非尼单药及索拉非尼联合人参皂苷Rg3对肝癌细胞的迁移抑制率均显著高于人参皂苷Rg3单药作用(P<0.01)，并且两药联合的抑制率显著高于索拉非尼单药(P<0.01)。见表2。Q=1.46>1.15，提示两药联合对肝癌细胞的迁移抑制作用具有协同作用。见表1。

2.3各组侵袭抑制率比较索拉非尼组和联合组侵袭抑制率均显著高于人参皂苷Rg3组(P<0.01)。见表1。Q=0.710，<0.85，提示两者联合对肝癌细胞侵袭抑制作用具有拮抗作用。

2.4各组VEGF-C、CD44V6、MMP-9蛋白表达HSCORE评分与阴性对照组比较，人参皂苷Rg3组CD44V6、MMP-9表达水平显著下降，索拉非尼组和联合组VEGF-C、CD44V6及MMP-9表达均显著下降(P<0.05)；与人参皂苷Rg3组比较，联合组VEGF-C及CD44V6水平显著下降；与索拉非尼组比较，联合组VEGF-C水平显著下降(P<0.05)。见表2。

表2　各组VEGF-C、CD44V6、MMP-9蛋白表达

与阴性对照组比较：1)P<0.05；与人参皂苷Rg3组比较：2)P<0.05；与索拉非尼组比较：3)P<0.05

3讨论

近年来中医中药的抗癌作用以其副作用小、作用温和等优点逐渐受到关注。人参皂苷 Rg3是人参中的有效活性成分，具有抗肿瘤的作用。索拉非尼是一种新型的多靶向治疗的抗肿瘤药物。

本研究中，人参皂苷 Rg3和索拉非尼对肝癌细胞的黏附均具有一定的抑制作用。人参皂苷Rg3在2 h时的抑制率显著高于1 h的抑制率，而索拉非尼抗黏附作用的时间依赖性不明显，具体原因期望在今后的研究中进一步明确。人参皂苷Rg3能够促进NO产生，诱导细胞的凋亡，其次能够抑制癌症细胞对细胞外基质的黏附作用，抑制肿瘤新生血管的形成，并降低细胞内的Ca2+〔6，7〕。本次研究结果显示，人参皂苷Rg3对肝癌细胞的黏附抑制作用相对较为温和，单药使用时作用相对较弱，而联合索拉非尼能够显著增加抑制率，并且两者有协同作用。

Transwell小室迁移实验是计数穿膜细胞个数，定量计算药物对细胞的迁移能力的影响。本研究显示索拉非尼和人参皂苷Rg3联合对肝癌细胞侵袭的抑制作用具有一定拮抗作用。

原发性肝癌侵袭过程中有多种黏附分子参与其中。CD44是一种细胞膜跨膜蛋白，也是一种黏附分子，CD44V6(CD44基因含v6外显子的变异体)，其变异部分位于细胞外，对黏附作用有显著的影响，介导转移，参与细胞与细胞，细胞与基质之间的黏附，与肝癌细胞血管浸润具有密切的关系〔8，9〕。MMP-9属于MMPs家族成员。MMPs在肝癌细胞浸润和转移过程及新生血管形成过程中发挥降解基质的作用，能够降解几乎所有的血管基底膜及细胞外基质〔10，11〕。另外其还具有升高血管生长因子的作用，调节细胞生长、促进血管生成，这些均在肝癌细胞的转移和侵袭过程中发挥重要作用。MMP-9主要降解破坏细胞外基质中Ⅳ型和Ⅴ型胶原及透明质酸〔12，13〕。VEGF在肿瘤生长和转移过程中的血管生成过程中具有重要的促进作用，是内皮细胞特异性有丝分裂原，能够诱导血管形成及血管的通透性〔14，15〕。在早期，其还能够诱导内皮细胞生成MMPs和组织因子，间接激活明胶酶原A降解基膜，从而促进细胞增殖。目前已知新生血管的生成是抗肿瘤治疗的重要的靶点之一。

综上，人参皂苷Rg3、索拉非尼单药及两药联合对肝癌细胞SMMC-7721细胞株的黏附、迁移、侵袭具有一定的抑制作用，对细胞的黏附和迁移抑制作用两者均具有协同作用，而其对肝癌细胞迁移、侵袭的抑制作用可能与降低细胞VEGF-C、CD44V6、MMP-9蛋白表达水平有关。

4参考文献

1Liu TG，Huang Y，Cui DD，etal.Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 combined with gemcitabine on angiogenesis and growth of lung cancer in mice〔J〕.BMC Cancer，2009；9(1)：250.

2Chen XP，Qian LL，Jiang H，etal.Ginsenoside Rg3 inhibits CX-CR4 expression and related migrations in a breast cancer cell line〔J〕.Int J Clin Oncol，2011；16(5)：519.

3周仁贵，周锡建，李相勇，等.索拉非尼联合化疗栓塞治疗晚期原发性肝癌的疗效分析〔J〕.现代生物医学进展，2014；14(13)：2494-6.

4杨明，罗克品，谢岳云，等.肝动脉化疗栓塞联合索拉非尼治疗中晚期肝细胞癌〔J〕.肝胆胰外科杂志，2013；25(4)：265-8.

5汪增秀.人参皂苷Rg3、索拉非尼、奥沙利铂不同联合方案抗人肝癌细胞株〔D〕.南京：南京医科大学，2012：10.

6戴小军，王维民，罗玉妍，等.人参皂苷免疫纳米对裸鼠人胃癌NUGC-4组织中血管内皮生长因子D表达的影响〔J〕.江苏中医药，2014;46(8)：76-8.

7董莉真，吴志敏，朱泽，等.人参皂苷Rg3调控ERK通路抑制Lewis小鼠肺癌生长的研究〔J〕.天津医科大学学报，2014;20(4)：271-4.

8王永辉，毛卫波，楼建，等.胃癌组织中CD44V6、p-Src、Ki67表达及其相关性〔J〕.温州医学院学报，2014;44(4)：272-7.

9Bourguignon LY，Wong G，Earle C，etal.Hyaluronan-CD44 interaction promotes c-Src-mediated twist signaling，microRNA-10b expression and RhoA/RhoC up-regulation，leading to Rho-kinase-associated cytoskeleton activation and breast tumor cell invasion〔J〕.J Biol Chem，2010;285 (47)：36721-35.

10德乐黑巴特尔，郭立娜.MMP-9及其与恶性肿瘤关联的研究进展〔J〕.内蒙古医学杂志，2014;25(6)：696-8.

11邵杰.人参皂苷Rg3及其与奥沙利铂和索拉非尼联合诱导肝癌细胞凋亡的实验研究〔D〕.南京：南京中医药大学，2012：12.

12Malla N，Berg E，Uhlin-Hansen L，etal.Interaction of promatrix metalloproteinase-9/proteoglycan heteromer with gelatin and collagen〔J〕.J Biol Chem，2008;283(20)：13652-65.

13华琼，华海清，杨爱珍，等.奥沙利铂和人参皂苷Rg3不同联合方式对人肝癌细胞株SMMC-7721作用的影响〔J〕.临床肿瘤学杂志，2013;18(2)：102-7.

14甘世新，姚景春，乔飞飞.头颈部鳞癌患者血清血管内皮生长因子和人表皮生长因子受体-2水平的检测及临床意义〔J〕.山西医药杂志，2014;43(9)：997-9.

15许金鹏，张慧慧，李朝品，等.原卟啉钠体外对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞的抑制作用〔J〕.中国实验方剂学杂志，2011;17(18)：173-8.

〔2014-11-21修回〕

(编辑苑云杰)

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1067-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.020

第一作者：陆玲玲(1985-)，女，硕士，住院医师，主要从事免疫性疾病研究。