老年大鼠股骨颈骨折术后神经营养因子、乙酰胆碱转移酶及突触素的改变

凌云志　禹　莉梁启胜　李晓红　林学武　(蚌埠医学院第一附属医院麻醉科，安徽　蚌埠　233004)



老年大鼠股骨颈骨折术后神经营养因子、乙酰胆碱转移酶及突触素的改变

凌云志禹莉1梁启胜李晓红林学武(蚌埠医学院第一附属医院麻醉科，安徽蚌埠233004)

〔摘要〕目的探讨老年大鼠股骨颈骨折术后对血清胶质细胞系来源的神经营养因子( GDNF)、乙酰胆碱转移酶( CHAT)及海马内突触素蛋白表达的影响。方法SD老年大鼠35只随机分为三组:空白组( K组，n=7)、对照组( D组，n= 14)、手术组( S组，n= 14)。D、S组根据处理时间不同各分2个亚组，D1、D3、S1、S3组(每组7只)。酶联免疫吸附法( ELISA)检测血清GDNF、CHAT浓度，HE染色检测海马组织病理变化，免疫组化检测海马内突触素蛋白的表达。结果S组血清GDNF、CHAT浓度均降低，与K组、D组相比差异显著( P＜0．05) ; HE染色显示D组和S组神经细胞缺失，形态改变;免疫组化结果表明D组和S组突触素表达较K组明显下降( P＜0．01，P＜0．05)。结论老年大鼠股骨颈骨折术后大鼠的空间学习记忆能力下降可能与血清GDNF、CHAT浓度降低，海马内突触素蛋白表达下调有关。

〔关键词〕股骨颈骨折;神经营养因子;乙酰胆碱转移酶;突触素

1蚌埠医学院医学检验系

第一作者:凌云志( 1977－)，男，博士，主治医师，讲师，主要从事麻醉脑保护研究。

术后认知功能障碍( POCD)是一种麻醉、手术后较为严重的神经系统并发症，是指手术后数天内发生的意识、认知、定向、思维、记忆以及睡眠等方面的紊乱，是老年患者术后早期较为显著的问题〔1〕。临床观察到骨科手术后，POCD的发生率相对较高，Berggren等〔2〕发现老年患者股骨颈骨折固定术后POCD的发生率高达44 %，由于病因仍不很清楚，给临床上预防和治疗带来一定困难。本课题组前期研究结果表明〔3〕老年大鼠股骨颈骨折术后可暂时影响大鼠的空间学习记忆能力，可能与血清Aβ1～40浓度升高以及海马内Bcl－2/Bax比例降低有关。本实验进一步探讨POCD的发生机制。

1材料与方法

1. 1实验动物及分组35只健康雄性清洁级SD大鼠由浙江省实验动物中心提供，合格证号: SCXK(浙) 20080033。月龄18～20个月，体质量450～500 g，实验前12 h禁食不禁水。采用随机数字表法分为五组: K组( n = 7)为空白组，不做任何麻醉及手术处理; D组( n = 14)为对照组，仅制作股骨颈骨折模型; S组( n=14)为手术组，制作股骨颈骨折模型，麻醉后行股骨颈骨折内固定术。D组、S组大鼠根据处理时间的不同各分为2个亚组，每组7只，分别为处理后1、3 d组(即D1、D3; S1、S3组)。

1. 2手术处理老年大鼠左股骨颈骨折模型制作成功后，行2%戊巴比妥钠2．5 ml/kg腹腔注射麻醉，待大鼠翻正反射消失后仰卧位固定，保持气道通畅。切开右腹股沟皮肤，游离暴露股静脉，然后进行小儿B－D套管针置管，建立静脉通道，乳酸钠林格注射液静脉维持输液，固定包埋套管针，缝合皮肤。常规消毒铺巾，在左侧股骨颈骨折部位，选择后外切口，切开皮肤、筋膜，分离肌层，暴露骨折断端，使用1．0 mm克氏针行骨折断端交叉固定，彻底止血后，逐层关闭缝合伤口，青霉素钠粉剂洒在伤口表面，术中呼吸平稳。术后伤口愈合好，分笼喂养，无手术死亡。

1. 3材料大鼠胶质细胞系来源的神经营养因子( GDNF) ELISA试剂盒及乙酰胆碱转移酶( CHAT) ELISA试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司) ;兔抗突触素抗体(美国Santa Cruz生物技术公司) ;免疫组化染色试剂盒(美国ZYEMD公司生产，北京中杉金桥生物技术有限公司分装)

1. 4方法

1. 4. 1取材抽取各组大鼠心脏血液2 ml，放置30 min自然凝固后，3 000 r/min离心10 min，取上清，－20℃保存用于检测血清GDNF和CHAT，试剂盒及检测均由上海雅吉生物科技有限公司完成。断头处死，迅速开颅取脑，于冰台上分离出海马组织，10 %甲醛固定24 h用于HE和免疫组化检测。

1. 4. 2 HE和免疫组化染色取甲醛固定的海马组织常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。冠状切片，片厚4 μm，行HE染色，光镜观察海马CA1区组织形态学变化，其余标本行SP免疫组化染色。脱蜡至水，3%过氧化氢封闭15 min，PBS冲洗，加入兔抗突触素抗体(稀释比例为1∶150)，为排除非特异性染色，部分切片以PBS代替一抗，37℃孵育2 h，PBS冲洗，加入即用型Ⅱ抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，脱水，封片。海马区出现黄褐色点状或颗粒状为阳性。在显微镜( Olympus，Japan)下观察突触素蛋白的表达，用图像分析系统( Image Pro Plus 6．0，美国)测其平均灰度值。

1. 5统计学方法采用SPSS16．0软件行单因素方差分析及q检验。

2结果

2. 1血清GDNF和CHAT检测与K组相比，D组、S组血清GDNF、CHAT浓度均降低( P＜0．01，P＜0．05)，与D1组、D3组分别相比，S1组、S3组差异均有统计学意义( P＜0．01，P＜0．05)。见表1。

表1各组大鼠血清GDNF和CHAT浓度比较( n=7±s)

表1各组大鼠血清GDNF和CHAT浓度比较( n=7±s)

与K组比较: 1) P＜0．05，2) P＜0．01;与D1组比较3) P＜0．05，4) P＜0．01;与D3组比较: 5) P＜0．05，6) P＜0．01

组别　GDNF( ng/L)　CHAT( pmol/L) K组　84．16±6．62　323．11±49．49 D1组　69．76±9．682)　262．60±28．432)D3组　71．88±8．371)　281．74±29．691)S1组　56．58±12．062) 3) 5)　193．38±38．372) 4) 6)S3组　58．75±9．492) 3) 6)　216．47±39．452) 3) 6)F/P值　9．780/＜0．01　13．054/＜0．01

2. 2 HE染色结果K组海马CA1区神经细胞排列整齐紧密，形态完整，数量较多，胞质丰富，胞核饱满，大而圆，着色均匀，深染，核仁清晰。D1和D3组与K组相比，神经细胞有缺失，数量减少，细胞排列散乱，胶质细胞稀疏变性，S1和S3组与K组相比，神经细胞缺失更明显，残留的神经细胞排列松散不规则，边界模糊，边缘出现空泡，胞核不规则，有的胞核消失，染色较浅，细胞数量明显减少，神经元胞体变小，见图1。

2. 3免疫组化检测结果从图2可以看出突触素免疫反应阳性产物呈板层分布，神经元内免疫阳性物质为棕黄色点状或颗粒状沉积。有些颗粒围绕在神经元周围，衬托出神经元胞体的轮廓。K组海马神经细胞周围突触素阳性染色颗粒较密集，染色较深且明显，锥体细胞排列紧密，整齐，结构清晰。D1和D3组海马神经细胞周围突触素阳性染色颗粒明显减少，稀疏，锥体细胞排列较疏松，细胞层次减少。S1和S3组突触素免疫阳性颗粒数量减少更明显，染色较浅且分布更为稀疏，低于K组和D组。定量分析结果显示D1和D3组海马CA1区突触素免疫反应产物的平均光密度值〔( 124．71±22．71)、( 119．29± 13．49)〕较K组〔( 147．14±21．88)〕明显降低，突触素表达下降( P＜0．05)，S1和S3组〔( 93．57±15．99)、( 96．86±18．63)〕较K组突触素表达平均灰度值降低更明显( P＜0．01)，S1和S3组分别与D1和D3组相比差异显著( P＜0．01，P＜0．05)。

图2各组突触素蛋白表达的结果( DAB，×100)

3讨论

GDNF来源于神经胶质细胞，是GDNF家族中的主要成员之一，发挥营养神经、抑制神经元变性坏死等作用，是对神经细胞的存活、增殖、分化、凋亡和轴突形成等多方面起调节作用的GDNF〔4，5〕。在神经系统发育中GDNF存在多种相互关联的信号传导通路，能够促进发育中神经元的存活、分化及正确迁移〔6〕。GDNF还可以对由各种原因造成损伤后的神经细胞有保护和修复作用〔7〕。研究报道，GDNF的缺乏与AD的发病密切相关〔8〕。有研究表明，将人胚胎神经干细胞植入外伤性脑损伤大鼠受损海马部位时大量表达和释放GDNF，并显著改善认知功能，动物空间学习和记忆能力显著提高〔9〕。本实验结果说明老年大鼠股骨颈骨折术后，血清GDNF浓度降低，这可能是影响老年大鼠股骨颈骨折术后认知功能障碍的原因之一。

乙酰胆碱作为脑内广泛分布的重要神经递质，与学习记忆的关系极为密切。CHAT是乙酰胆碱合成的限速酶，可作为胆碱能神经元活性的标志，痴呆老龄鼠学习记忆能力降低与胆碱能神经密切相关，进一步的实验证明CHAT活性变化能够判断胆碱能神经功能，CHAT活性降低是导致学习记忆障碍的重要原因〔10，11〕。Dunbar等〔12〕研究发现水迷宫作业表现较好的大鼠海马中乙酰胆碱化酶活性和胆碱摄取量较高。脑的活栓和尸检清楚地显示在老年性痴呆患者脑皮层CHAT活性显著降低，且CHAT水平与神经炎性斑和MMSE简易智能量表成绩高度相关。本实验结果说明老年大鼠股骨颈骨折术后血清CHAT浓度降低，这可能是导致老年大鼠股骨颈骨折术后学习记忆能力下降，发生术后认知功能障碍的原因之一。

海马是神经元退行性变发生的易感区域，海马神经元的退变和丢失是正常老化的最常见的特点，也是导致与老化相关的学习记忆功能减退的直接原因。本文结果说明老年大鼠股骨颈骨折术后发生神经元细胞的缺失与退变，从而导致学习记忆功能的减退。

突触是神经元之间的功能接触部位，其结构和功能的完整对神经元的信息传递、加工和贮存十分重要。学习记忆与中枢神经系统突触的结构和功能的可塑性密切相关。突触素是一种与突触结构和功能密切相关的膜蛋白，可作为突触前终末特异性标记物用来客观反应突触的密度和分布，已有研究〔13〕发现突触素免疫活性与AD患者的认知障碍程度相关。本实验结果说明老年大鼠股骨颈骨折术后突触素表达明显下降，反映了突触数量的减少和突触素合成能力的减弱，突触素减少将导致神经系统的信息传递、加工和储存出现障碍，神经递质释放异常，最终出现行为功能异常。老年大鼠股骨颈骨折术后出现学习记忆功能减退可能与突触素蛋白表达的减少有直接关系。

综上所述，胶质细胞系来源的GDNF、胆碱能神经元的特异性标志酶CHAT和神经元突触的特异性标志物突触素对于维持学习记忆功能具有关键的作用，本研究表明，老年大鼠在股骨颈骨折术后血清GDNF和CHAT浓度的降低、海马突触素蛋白表达减少可能是导致老年大鼠股骨颈骨折术后学习记忆能力减退的重要机制。GDNF、CHAT和突触素能否作为术后认知功能障碍早期预测指标和治疗的靶点还有待于进一步的实验和临床研究。

4参考文献

1 Saravay SM，Kaplowitz M，Kurek J，et al．How do delirium and dementia increase length of stay of elderly general medical inpatients〔J〕．Psychosomatics，2004; 45( 3) : 235－42．

2 Berggren D，Gustafson Y，Eriksson B，et al．Postoperative confusion after anesthesia in elderly patients with femoral neck fractures〔J〕．Anesth Analg，1987; 66( 6) : 497－504．

3凌云志，禹莉，梁启胜，等．老年大鼠股骨颈骨折术后认知功能及Aβ1－40、Bax、Bcl－2改变的研究〔J〕．中国老年学杂志，2013; 33( 18) : 4489－91．

4 Zhang Y，ZhuW，Wang YG，et al．Interaction of SH2－Bbeta with RET is involved in signaling of GDNF－induced neurite outgrowth〔J〕．J Cell Sci，2006; 119( 8) : 1666－76．

5 Airaksinen MS，Saarma M．The GDNF family: signalling，biological functions and therapeutic value〔J〕．Nat Rev Neurosci，2002; 3( 5) : 383－94．

6郭瑾，徐群渊．胶质细胞系源性神经营养因子在神经元发育中的生物学功能〔J〕．中国临床康复，2006; 10( 18) : 126－8．

7 Krieglstein K．Factors promoting survival of mesencephalic dopaminergic neurons〔J〕．Cell Tissue Res，2004; 318( 1) : 73－80．

8 Pertusa M，Garcia－Matas S，Mammeri H，et al．Expression of GDNF transgene in astrocytes improves cognitive deficits in aged rats〔J〕．Neurobiol Aging，2008; 29( 9) : 1366－79．

9 Gao J，Prough DS，Mcadoo DJ．Transplantation of primed human fetal neural stem cells improves cognitive function in rats after traumatic brain injury〔J〕．Exp Neurol，2006; 201( 2) : 281－92．

10 White AM，Mattews DB，Best PJ．Ethanol，memory，and hippocampal function: a review of recent findings〔J〕．Hippocampus，2000; 10( 1) : 88－93．

11 Park D，Joo SS，Kim TK，et al．Human neural stem cells overexpressing choline acetyltransferase restore cognitive function of kainic acid－induced learning and memory deficit animals〔J〕．Cell Transplant，2012; 21( 1) : 365－71．

12 Dunbar GL，Rylett RJ，Schmidt BM，et al．Hippocampal choline acetyltransferase activity correlates with spatial learning in aged rats〔J〕．Brain Res，1993; 604( 1－2) : 266－72．

13 Cao Y，Xiao Y，Ravid R，et al．Changed clathrin regulatory proteins in the brains of Alzheimer's disease patients and animal models〔J〕．J Alzheimers Dis，2010; 22( 1) : 329－42．

〔2014－12－19修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

通讯作者:禹莉( 1979－)，女，硕士，副教授，主要从事诊断分子生物学研究。

基金项目:安徽省高等学校自然科学研究一般项目( KJ2015B004by) ;蚌埠医学院重点课题( BYKY1424ZD)

〔中图分类号〕R614. 4

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0287-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 014