大蒜素促进人子宫内膜癌细胞株( RL－952)细胞凋亡的机制

张　彬　陈丽红　陈秀慧　林　瑶　(福建医科大学附属第一医院妇产科，福建　福州　350005)



大蒜素促进人子宫内膜癌细胞株( RL－952)细胞凋亡的机制

张彬陈丽红陈秀慧林瑶(福建医科大学附属第一医院妇产科，福建福州350005)

〔摘要〕目的探讨大蒜素诱导人子宫内膜癌细胞株( RL－952)细胞凋亡的相关机制。方法人子宫内膜癌细胞株RL－952经大蒜素或Janus激酶/信号传导及转录液活因子( JAK/STAT3)通路抑制剂AG490共培养后，MTT比色法检测药物对TL－952肿瘤细胞的抑制率;采用Real－time PCR和酶联免疫吸附( ELISA)法检测各组细胞中JAK/STAT3信号转导通路相关蛋白或mRNA及细胞凋亡蛋白的表达情况。结果大蒜素能够剂量和时间依从性地抑制人子宫内膜癌细胞株RL－952的增殖;且大蒜素和AG490孵育人子宫内膜癌RL－952细胞株后细胞内JAK/STAT3转导通路相关蛋白JAK和STAT3的表达明显减弱，同时促细胞凋亡蛋白Bax、P53的表达明显增高、抑制凋亡蛋白Bcl2表达明显降低，且与对照组细胞差异显著( P＜0．01)。结论大蒜素能够有效抑制肿瘤细胞增殖的作用，且其可能的机制是通过抑制JAK/STAT3信号转导通路实现。

〔关键词〕大蒜素;子宫内膜癌;抑制率; JAK/STAT3信号转导通路;剂量依从性

子宫内膜癌是临床上最常见的妇科恶性肿瘤之一，且患者具有较差的预后〔1〕。近年来，子宫内膜癌的多发病率和死亡率有逐年升高的趋势，且常见于围绝经期和绝经后的女性〔2〕。子宫内膜癌的发病机制尚不明确，可能与激素的使用、糖尿病、肥胖等因素有关。子宫内膜癌在临床的极早期无明显的症状，之后可能会出现不规则的阴道出血、阴道分泌物增加、不明原因的阵发性下腹痛以及腹部包块等。Janus激酶/信号传导及转录激活因子( JAK/STAT3)信号转导通路是细胞内的一条多细胞因子共同参与的途径，其与MAPK信号转导通路共同介导了细胞外刺激引起的多种肿瘤细胞的增殖、分化、转移及凋亡的病理学过程。JAK/STAT3信号通路与多种恶性肿瘤的发生有密切相关性〔3〕。大蒜素主要存在于大蒜的鳞茎中，为三硫代烯醚类化合物，对多种致病菌均有抑制作用。同时，以往的研究也表明大蒜素具有防止肝纤维化、降低胆固醇和抗肿瘤的作用〔4〕。本研究主要对大蒜素诱导人子宫内膜癌细胞株( RL－952)细胞凋亡过程的相关信号转导通路进行研究，为临床上相关治疗提供参考。

1材料与方法

1. 1材料与试剂人子宫内膜癌RL－952购自美国典型物种保藏中心;细胞培养板为美国Costar产品;胎牛血清购自杭州四季青公司;青霉素和链霉素购自Sigma Aldrich公司; DMEM培养基购自Hyclone公司; mRNA提取及逆转录试剂盒购自北京天根生物技术有限公司;总蛋白提取试剂盒购自南京建成生物工程研究所;酶联免疫吸附( ELISA)检测相关试剂盒均购自美国OMEGA公司。

1. 2 RL－952细胞培养与研究分组RL－952细胞株在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中37℃，5%二氧化碳、饱和湿度培养条件下进行贴壁培养。将生长状态良好的肿瘤细胞随机分为对照组、大蒜素低剂量处理组( 12 μg/ml)、大蒜素中剂量处理组( 24 μg/ml)、大蒜素高剂量处理组( 48 μg/ml)和AG490处理组( 10 mmol/L)。

1. 3四甲基偶氮唑盐( MTT)试验将RL－952肿瘤细胞接种至96孔细胞培养板中在1. 2的培养条件下进行培养。待细胞生长良好后在各组细胞加入相应药物(大蒜素或AG490)培养24、48、72 h。然后弃去培养液并加入20 μl MTT温孵4 h，在每个培养孔中加入二甲基亚砜( DMSO)振荡溶解，用酶标仪检测各个细胞培养空的吸光度，并计算细胞增殖的抑制率。抑制率=(对照组吸光度－试验组吸光度) /对照组吸光度×100%。

1. 4 ELISA法检测相关蛋白表达各组肿瘤细胞培养后的蛋白提取均严格按照说明书进行操作。采用考马斯亮蓝法进行总蛋白的定量。ELISA法检测相关蛋白的表达均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1. 5 Real－time PCR检测相关蛋白mRNA表达mRNA的提取及逆转录过程均按照说明书进行操作。荧光定量PCR的扩增体系为: 2×qPCR mix 5 μl，上游和下游引物分别为1 μl，cDNA 2 μl，去离子水1 μl。扩增条件为: 95℃10 s，60℃40 s，共扩增28个循环。采用△Ct计算各组mRNA的表达。

1. 6统计学方法采用SPSS20．0软件进行方差分析、χ2检验。

2结果

表1 MTT法检测大蒜素和JAK/STAT3抑制剂AG490对人子宫内膜癌细胞株RL-952细胞的抑制作用( %)

2. 1 MTT法检测大蒜素对人子宫内膜癌细胞株RL－952细胞的抑制作用表1可见，MTT法检测证实大蒜素和JAK/STAT3通路抑制剂AG490均能够对人子宫内膜癌细胞株RL－952发挥增殖的抑制作用，且大蒜素具有抑制作用的时间依从性和剂量依从性。

2. 2大蒜素调节肿瘤细胞JAK蛋白和mRNA的表达分析本研究发现大蒜素和AG490能够有效抑制JAK蛋白和mRNA的表达水平，且与对照组相比差异显著( P＜0．05，P＜0．01) ;同时，AG490组与低剂量和中剂量大蒜素组之间也具有显著差异( P＜0．05，P＜0．01)。见表2。

表2 ELISA和Real-time PCR法检测JAK蛋白和mRNA的表达(±s)

表2 ELISA和Real-time PCR法检测JAK蛋白和mRNA的表达(±s)

与对照组比较: 1) P＜0．05，2) P＜0．01;与低剂量组比较: 3) P＜0．05，4) P＜0．01;下表同

组别　JAK蛋白/β－actin pJAK蛋白/β－actin JAK mRNA表达(△Ct)对照组　0．76±0．18　 0．53±0．08　 5．30±0．19大蒜素低剂量组　0．75±0．19　 0．55±0．04　 5．22±0．14大蒜素中剂量组　0．55±0．101) 3)　0．43±0．09　 4．54±0．111) 3)大蒜素高剂量组　0．35±0．082) 4)　0．39±0．11　 3．83±0．102) 4)AG490组　0．31±0．072) 4)　0．27±0．09　 3．67±0．082) 4)

2. 3大蒜素调节肿瘤细胞STAT3蛋白和mRNA的表达分析大蒜素能够有效提高ERK1/2蛋白的表达，且与对照组细胞的表达存在显著差异( P＜0．05，P＜0．01)。见表3。

2. 4 ELISA法检测p53、Bax及Bcl2蛋白的表达大蒜素和AG490能够有效提高上调Bax和p53蛋白水平，抑制Bcl2蛋白表达，且与对照组细胞的表达存在显著差异( P＜0．05，P＜0．01)。见表4。

表3 ELISA和Real-time PCR法检测STAT3蛋白和mRNA的表达(±s)

表3 ELISA和Real-time PCR法检测STAT3蛋白和mRNA的表达(±s)

组别　STAT3蛋白/β－actin pSTAT3蛋白/β－actin STAT3 mRNA表达(△Ct)对照组　0．89±0．15　 0．73±0．11　 7．30±0．21大蒜素低剂量组　0．85±0．19　 0．71±0．09　 7．21±0．15大蒜素中剂量组　0．75±0．131) 3)　0．63±0．10　 6．56±0．141) 3)大蒜素高剂量组　0．63±0．182) 4)　0．59±0．10　 4．83±0．162) 4)AG490组　0．51±0．142) 4)　0．47±0．11　 4．69±0．112) 4)

表4 ELISA法检测p53、Bax及Bcl2蛋白的表达

2. 5大蒜素及AG490促进细胞凋亡的DAPI染色法分析

DAPI染色后中、高剂量大蒜素组和AG490组肿瘤细胞存在部分皱缩、细胞内可见部分凋亡小体，而小剂量雷帕霉素对细胞的形态基本无明显影响，见图1。

图1大蒜素及AG490促进细胞凋亡的DAPI染色法分析( bar=100 μm)

3讨论

大蒜素为黄色或淡黄色油状液体，具有多种生理学活性。以往的研究表明大蒜素能够保护大鼠脊髓缺血再灌注损伤〔5〕、减轻甲基苄基亚硝胺诱发的食管癌〔6〕，并能有效调剂大鼠肺组织中水通道蛋白的表达〔7〕。本研究提示大蒜素能够有效抑制肿瘤细胞增殖的作用，且其可能的机制是通过抑制JAK/STAT3信号转导通路实现。

JAK/STAT3信号通路是细胞内最主要的信号通路，与多种肿瘤的病理过程密切相关〔8〕。在对JAK/STAT信号通路与肝细胞性肝癌的肿瘤进展和预后的相关性研究中发现JAK/STAT信号通路的过度激活在肝癌的发生和发展过程中发挥着重要的作用，且可以作为肝癌恶性程度及预后的重要参考指标〔9〕。在对肝癌患者血清肿瘤标志物含量检测及其与肿瘤组织中JAK－STAT通路的关系研究时也发现肝癌患者血清中增殖和黏附分子、去乙酰化酶和甲基转移酶的水平异常升高，这些分子可以作为肝癌的重要血清标志物，而这些标志物的水平与JAK/ STAT3信号转导通路的异常激活密切相关〔10〕。本研究表明JAK/STAT信号通路参与了大蒜素诱导的子宫内膜癌细胞凋亡过程。

大蒜素能够有效促进肿瘤细胞凋亡，且能够协同抗肿瘤药物的杀伤肿瘤细胞的作用〔11〕。在分析大蒜素对大鼠自然杀伤( NK)细胞肿瘤杀伤活性的影响研究中发现大蒜素可能通过上调NK细胞分泌干扰素( IFN)－γ的水平，增强其体外肿瘤杀伤能力〔12〕。在大蒜素抑制肿瘤生长机制的实验研究中也证实大蒜素能够通过抑制血管内皮细胞生长因子( VEGF)的表达、抑制肿瘤的血管生成来实现肿瘤生长的抑制作用〔13〕。大蒜素联合顺铂对大鼠膀胱肿瘤生长抑制和诱导凋亡的实验研究也显示大蒜素联合顺铂可共同诱导细胞凋亡发挥协同效应，从而抑制膀胱肿瘤的生长，进而改善大鼠的生存状态〔14〕。

4参考文献

1王飞艳，徐红，何中慧，等．Ebp50、Ezrin在子宫内膜癌中的表达及意义〔J〕．中国现代医学杂志，2013; 21( 33) : 32－6．

2李方，付焱，李俊玉，等．COMT活性与子宫内膜癌发生和发展相关〔J〕．肿瘤，2012; 32( 2) : 119－23．

3杨艳，滕银成．端粒酶逆转录酶与子宫内膜癌的研究进展〔J〕．现代妇产科进展，2011; 20( 1) : 58－60．

4蒋淑婉，李云，陈鹤．大蒜素的抗肿瘤作用及其机制研究进展〔J〕．医学综述，2013; 19( 8) : 1420－2．

5王冰，李兵．大蒜素对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕．中华神经外科疾病研究杂志，2013; 12( 6) : 513－6．

6辛国华，梁宗英，张乐，等．大蒜素对不同浓度甲基苄基亚硝胺诱发大鼠食管癌抑制作用实验研究〔J〕．临床和实验医学杂志，2013; 17 ( 24) : 1957－60．

7陈华文，冯俊，易旻晓，等．大蒜素对脂多糖诱导的大鼠肺组织水通道蛋白－1表达的影响〔J〕．中国中医急症，2013; 45( 12) : 1999－2000．

8洪璇，张艳桥．JAK－STAT信号传导通路在肿瘤中的研究进展〔J〕．基础医学与临床，2011; 31( 4) : 463－6．

9张斌，钟德玝，王群伟，等．JAK/STAT信号通路与肝细胞性肝癌的肿瘤进展和预后的相关性研究〔J〕．细胞与分子免疫学杂志，2010; 26 ( 4) : 368－70．

10董智刚，马丽丽，李亚娟，等．肝癌患者血清肿瘤标志物含量检测及其与肿瘤组织中JAK－STAT通路的关系研究〔J〕．海南医学院学报，2015; 21( 9) : 33－8．

11王广彬，赵瑞杰，王文魁，等．大蒜素诱导肿瘤细胞凋亡研究进展〔J〕．动物医学进展，2010; 31( 1) : 73－6．

12徐丽，吕丽虹，俞建东，等．大蒜素对大鼠NK细胞肿瘤杀伤活性的影响〔J〕．中国病理生理杂志，2010; 26( 11) : 2091－6．

13陈逸恒，刘燕，石纬．大蒜素抑制肿瘤生长机制的实验研究〔J〕．中华肿瘤防治杂志，2010; 17( 15) : 1168－71．

14周生财，唐伟．大蒜素联合顺铂对大鼠膀胱肿瘤生长抑制和诱导凋亡的实验研究〔J〕．重庆医科大学学报，2008; 33( 1) : 45－8．

〔2015－03－27修回〕

(编辑袁左鸣)

基金项目:福建省教育厅科技项目( No．JB08115)

〔中图分类号〕R737. 33

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0285-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 013

第一作者:张彬( 1973－)，女，硕士，副主任医师，副教授，主要从事妇科肿瘤、妇科内分泌研究。