响应面分析法对蒲公英药材中有机酸类成分提取工艺的优化

2016-04-08焦红军许真真

山东医药 2016年18期

关键词：有机酸绿原蒲公英

焦红军，许真真

(郑州大学第二附属医院，郑州450001)

·药学研究·

响应面分析法对蒲公英药材中有机酸类成分提取工艺的优化

焦红军，许真真

(郑州大学第二附属医院，郑州450001)

目的探讨响应面分析法优化蒲公英药材中有机酸类成分的提取工艺。方法采用高效液相色谱法，以绿原酸、咖啡酸及阿魏酸含量为测定指标，通过响应面分析法考察溶剂浓度、液料比、提取时间对提取工艺的影响，对结果进行二项式回归模型拟合，优化提取工艺。结果最佳提取工艺乙醇浓度为62.88%，料液比为16.17∶1，提取时间为 65.42 min，回流提取2次，总评归一值预测值为0.982 0；实际测得绿原酸、咖啡酸及阿魏酸提取量分别为771.2、472.4、28.5 μg/g，总评归一值为0.979 8，与理论预测值差异无显著性(P>0.05)。结论响应面分析法能较好地拟合蒲公英药材中绿原酸、咖啡酸及阿魏酸提取工艺，所预测值与试验值吻合较好。

响应面分析法；蒲公英；绿原酸；咖啡酸；阿魏酸；提取工艺

蒲公英的主要有效成分为绿原酸、咖啡酸及阿魏酸等有机酸类[1～4]，但尚缺乏对其的有效开发与利用。在以往中药材的提取工艺研究中，正交实验设计优化提取工艺居多[5～7]，但实验结果不精确。响应面分析方法是采用二项式模型，拟合值更接近真实值。2015年3～6月，我们利用响应面分析法，以绿原酸、咖啡酸及阿魏酸提取率的总评归一值为质控指标，优选蒲公英药材有机酸类成分的提取条件。

1　仪器与试药

蒲公英药材经鉴定为为菊科植物蒲公英、碱地蒲公英或同属种植物的干燥全草。2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，2998 紫外检测器(美国Waters公司)；小型超声波清洗机KM-615A(广州市科洁盟实验仪器有限公司)，CPA225D十万分之一天平(德国赛多利斯)；绿原酸、咖啡酸、阿魏酸对照品购于中国药品生物制品检定所，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1绿原酸、咖啡酸及阿魏酸测定方法的建立

2.1.1蒲公英的提取取蒲公英粗粉10 g，将蒲公英提取液浓缩，用甲醇定容至25 mL；精密吸取5 mL，用甲醇溶解并定容至25 mL；用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.1.2色谱条件采用Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B) 为流动相，梯度洗脱(0～15 min，12% A；15～40 min，12%～32% A)，柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长320 nm。理论塔板数按绿原酸峰计算不低于3 000 ng。

2.1.3对照品溶液的制备称取绿原酸对照品0.723 mg、咖啡酸对照品0.421 mg,吸取34 μg/mL阿魏酸对照溶液1 mL，置10 mL容量瓶中；加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.1.4线性关系分析吸取上述混合对照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入色谱仪；以进样量为自变量，色谱峰面积为因变量，绘制标准曲线，建立回归方程：y=1 725.8x+22 047，r=0.999 5，y=2 578.2x+11 342，r=0.999 4，y=1 201.4x+693.1，r=0.999 1。提示绿原酸、咖啡酸及阿魏酸分别在144.6～1 446 ng、84.2～842 ng、6.8～68 ng内线性关系良好。

2.2单因素试验

2. 2. 1乙醇浓度的影响取蒲公英粗粉10 g，选择0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇作为提取溶剂，液料比为 20∶1，回流提取 60 min，提取2次；按2.1.2项条件测定。结果60%乙醇浓度时，有机酸类成分提取量较高，故选择60%乙醇作为提取溶剂。

2.2.2液料比的影响取蒲公英粗粉10 g，以 60% 乙醇作为提取溶剂，提取时间为60 min，以5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1的料液比，进行回流提取，提取次数2次，按2.1.2项条件测定。结果料液比15∶1对提取量的影响较小，故选择15∶1作为料液比。

2.2.3提取时间的影响取蒲公英粗粉10 g，以 60% 乙醇作为提取溶剂，液料比为 15∶1，回流提取 60 min，提取2次，以提取时间为 20、40、60、80、100、120 min 进行回流提取，按2.1.2项条件测定。结果60 min后提取时间对提取量的影响较小，故选择60 min作为提取时间。

2.3响应面分析法优选提取工艺

2.3.1回归模型建立及方差分析通过单因素试验，确定以乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)为考察因素，响应面试验设计水平分为-1、0、1，设计三因素三水平17个试验点的响应面分析。以绿原酸、咖啡酸及阿魏酸提取量进行综合考量，得总评归一值(OD)[8]。采用Design Expert软件处理，逐步递减回归，以P<0.05为标准得OD值的回归方程为OD=-10.574 539+0.336 41A+0.0872 57B+7.790 78×10-3C-1.814 91×10-5AB+1.394 23×10-5AC-1.102 23×10-4BC-2.680 21×10-3A2-2.440 50×10-3B2+5.260 72×10-5C2。对OD值模型进行方差分析，结果回归模型极其显著(P<0.000 1)。模型的一次项中A显著，二次项A2和B2影响为显著，提示所选各因素对结果的影响排序为乙醇浓度>液料比>提取时间。

2.3.2最佳提取工艺的验证以OD值为考核指标，蒲公英药材中有机酸类的最佳提取工艺为: 乙醇浓度为62.88%，料液比为 16.17∶1 ，提取时间为 65.42 min，此条件下的OD值预测值为0.982 0。结合实际试验，将溶剂浓度定为 63%，料液比定为16∶1，提取时间定为 65 min，提取2次，实际测得绿原酸、咖啡酸及阿魏酸提取量分别为771.2 μg/g、472.4 μg/g、28.5 μg/g，OD值为0.979 8，这与理论预测值差异无显著性(P>0.05)。

3　讨论

蒲公英为中国传统中药材，具有较强的抗菌、抗肿瘤、利尿作用[9～11]。蒲公英的研究文献较少，其提取工艺研究报道甚少。本文通过响应面分析方法研究蒲公英药材中有机酸类成分的提取工艺，筛选最佳的提取工艺。首先，本实验通过检测蒲公英药材中有机酸类成分的含量，建立了其质量控制指标的检测方法。综合考察蒲公英主要有效成分绿原酸、咖啡酸及阿魏酸含量，来衡量蒲公英提取工艺，结果更为合理。从试验结果显示，乙醇浓度、料液比、提取时间为蒲公英药材中有机酸成分提取工艺的影响因素，3个因素之间相互影响，对最终结果的贡献不是常规意义上的线性模型[12,13]。因此，如果采用正交设计提取工艺，结果失真。响应面分析法设计的原理是拟合二项式模型方程，以相应面优化提取条件，尽最大程度地拟合真实值，从而缩小了预测值与真实值的差异，结果更可信。本研究提取过程中，绿原酸、咖啡酸及阿魏酸含量往往相互影响，因此需要采综合模式进行优化；OD值正是将有机酸类成分的提取率综合作为指标，与提取条件构成响应面，筛选最佳工艺。

因此，响应面分析法能较好地拟合蒲公英药材中有机酸类成分的提取工艺，二项式拟合模型更靠近真实情况。最终，通过响应面分析法，确定最佳提取工艺，63%乙醇浓度，16∶1的料液比，提取时间65 min，回流提取2次。这为工业化生产合理利用蒲公英资源提供了理论依据，并且为扩大蒲公英的应用与开发提供了一定的理论基础和参考。

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