沙利度胺联合表阿霉素对小鼠H22肝癌细胞增殖、侵袭与凋亡的影响

高军，祝小英，石庆芳，王大庆，姜达(衡水哈励逊国际和平医院，河北衡水053000;河北医科大学第四医院)



·基础研究·

沙利度胺联合表阿霉素对小鼠H22肝癌细胞增殖、侵袭与凋亡的影响

高军1，祝小英1，石庆芳1，王大庆1，姜达2(1衡水哈励逊国际和平医院，河北衡水053000;2河北医科大学第四医院)

摘要：目的探讨沙利度胺联合表阿霉素对小鼠肝癌p2细胞的增殖、侵袭与凋亡的影响。方法 取处于对数生长期的小鼠p2肝癌细胞，随机分为4组，分别加入生理盐水(生理盐水组)、沙利度胺50 μg/mL(沙利度胺组)、表阿霉素5 μg/mL(表阿霉素组)及沙利度胺50 μg/mL联合表阿霉素5 μg/mL(联合组)，采用MTT法检测各组细胞增殖抑制率，侵袭实验检测细胞穿透数，并采用流式细胞仪测算各组细胞凋亡率。结果 联合组p2细胞增殖抑制率、细胞凋亡率明显高于另外三组(P均<0.05)，细胞穿透数显著低于另外三组(P<0.05)。沙利度胺组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率明显低于表阿霉素组(P均<0.05)，细胞穿透数显著高于表阿霉素组(P<0.05)。结论 沙利度胺能很好地协同表阿霉素抑制小鼠p2肝癌细胞的增殖及侵袭，并促进细胞凋亡。

关键词：肝肿瘤；沙利度胺；表阿霉素;小鼠

肝癌发病率逐年增长，在我国居于第2位[1]。肝癌的发展速度快、转移力强，临床治疗效果及预后欠佳[2]。沙利度胺是目前被证实的具有血管生成抑制作用的药物，其曾因致畸作用而被禁用，但近年来发现其具有抗血管生成及免疫调节作用，大量研究发现其在胃癌、原发性肝癌及多发性骨髓瘤等治疗中均有一定效果，并有相关研究证实其通过调节体内部分生长因子表达而发挥作用[3～5]。2009年6月～2013年9月，我们观察了沙利度胺及表阿霉素干预后对小鼠p2肝癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。

1材料与方法

1.1材料小鼠p2肝癌细胞株由河北医科大学第四医院提供，置于pH 7.2～7.4(含10%胎牛血清及2.5 mmol/L谷氨酰胺)DMEM/F12培养基(上海拜力生物科技)中，于37 ℃、5%CO2细胞培育箱中，饱和湿度条件下常规无菌培养，倒置显微镜下观察细胞贴壁生长良好，无退化，取对数生长期细胞进行实验。沙利度胺片剂(江苏常州制药，国药准字：h12026129)，研成粉末状，悬于生理盐水中配制混悬液；注射用盐酸表阿霉素(辉瑞制药，国药准字：p0000496)，生理盐水配制1 mg/mL实验用液。MEM液(Chemicon公司)，Annexin V-FITC(R&D公司)，PI(R&D公司)，二甲基亚砜(Sigma公司)。酶联免疫检测仪(芬兰Multiskan MK3)，流式细胞仪(美国Guava easyCyte 6-2L)。

1.2细胞增殖抑制率测算采用MTT法。取处于对数生长期的p2细胞，用0.25%胰酶(Sigma公司)消化后离心制备单细胞悬液，以每孔8.0×104/mL接种于96孔培养板中，200 μL/孔，加入培养液，边缘孔加无菌PBS液，置于培养箱过夜。对照组加生理盐水，沙利度胺及表阿霉素组分别加沙利度胺 50 μg/mL、表阿霉素 5 μg/mL，联合组加沙利度胺 50 μg/mL、表阿霉素 5 μg/mL(沙利度胺、表阿霉素均溶于二甲基亚砜制备原液贮存待用)，每孔均为200 μL。37 ℃培养48 h时加入20 μL的MTT液(5 mg/mL)继续培养4 h后出现结晶，吸去培养液加150 μL二甲基亚砜，摇床振荡15 min，使用酶联免疫检测仪于570 nm处检测溶液吸光度(OD值)，重复3次。细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3细胞穿透数测算进行细胞侵袭实验。Matrigel胶使用MEM液稀释，取30 μL均匀包被Transwell小室，4 ℃过夜，收集对数生长期细胞，随机分为对照组、沙利度胺组、表阿霉素组及联合组，分别加入生理盐水、沙利度胺、表阿霉素、沙利度胺+表阿霉素，剂量同前，用无血清MEM培养液重悬细胞后置入24孔板，上室加入5×103/200 μL无血清细胞悬液，下室加入500 μL的MEM培养液,37 ℃、5%CO2培养箱孵育24 h后，拭去基质胶及上室细胞，4%多聚甲醛固定下室细胞，染色后显微镜观察，取5个不同视野计数穿透细胞数取均值，重复3次。

1.4细胞凋亡率测算取对数生长期p2细胞，常规胰酶消化，以4×105/mL接种至培养瓶，培养24 h后细胞贴壁生长吸去上清液，随机分为对照组、沙利度胺组、表阿霉素组及联合组，分别加入生理盐水、沙利度胺、表阿霉素、沙利度胺+表阿霉素，剂量同前，继续培养48 h。PBS液清洗离心2遍，再次消化，收集所有细胞，70%乙醇(4 ℃预冷)固定30 min，PBS冲洗后加入5 μL Annexin V-FITC及10 μL PI溶液混匀置于流式管中，室温避光溴化丙啶1 mL染色30 min后使用流式细胞仪进行DNA定量，并依据细胞周期分布检测并计算出细胞凋亡率。

2结果

2.1各组肝癌p2细胞增殖抑制率比较见表1。

2.2各组肝癌p2细胞穿透数比较对照组细胞贴壁生长良好，排列紧密，透亮度好，沙利度胺组、表阿霉素组及联合组细胞均排列较稀疏，悬浮细胞增多，细胞皱缩明显，胞核固缩，形态改变，遮光能力降低。各组肝癌p2细胞穿透数比较见表1。

2.3各组肝癌p2细胞凋亡率比较见表1。

注：与生理盐水组比较，*P<0.05；与表阿霉素组比较，△P<0.05；与联合组比较，○P<0.05。

3讨论

沙利度胺最初作为镇静药物应用于临床，近年研究证实其具有抗血管生成及免疫调节作用。潘骥群等[6]研究发现其具有抑制bFGF及VEGF表达的作用，并提出沙利度胺具有抗血管生成作用。表阿霉素属于抗生素类抗肿瘤药物，其可干扰转录过程，从而抑制DNA及RNA合成，对多种实性肿瘤均有良好效果[7]。

浸润和转移是恶性肿瘤的重要特征，通过抑制血管增生来控制肿瘤的发展是一种有效的方法。肿瘤细胞的快速成长有赖于新生血管的形成，并同时通过新生血管形成肿瘤细胞的转移途径[8]。与传统抗肿瘤治疗相比，抗血管生成治疗具有起效快、不易产生耐药性的优势。因此针对新生血管的靶向治疗成为近年抗肿瘤治疗的热点[9]。

本研究我们发现，沙利度胺联合表阿霉素对小鼠p2肝癌细胞增殖抑制较强，且在侵袭实验中发现两药联用能显著降低肿瘤细胞的穿透数，且流式细胞检测证实联合用药能促进肿瘤细胞凋亡，因此，沙利度胺联合表阿霉素能对小鼠p2肝癌细胞生长起到明显抑制作用。本研究发现，沙利度胺作用后肝癌细胞DNA直方图G1期峰前出现细胞凋亡峰亚G1期，揭示沙利度胺能很好地协助表阿霉素抑制小鼠p2肝癌细胞的增殖及侵袭，并促进细胞凋亡，诱导细胞凋亡可能为其抑制肝癌细胞的作用机制之一，王喜安等[10]研究发现沙利度胺治疗小鼠HAC能明显降低瘤重，抑瘤率为50.1%。

目前诸多实验证实沙利度胺联合某种化疗药物可达到良好的协同作用，较药物单用效果明显。其抗肿瘤作用可能通过抑制肿瘤细胞DNA、RNA的合成，直接杀伤肿瘤细胞；两药联用，一方面抑制肿瘤细胞本身的分裂增生，另一方面抑制肿瘤新生血管形成，减少瘤体营养供应，产生较好的肿瘤抑制效应。

参考文献：

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基金项目：衡水市科学技术研究与发展指导计划项目(09021Z)。

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.008

中图分类号：R735.7

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)13-0023-02

(收稿日期：2015-10-28)