基于丹顶鹤和大鸨病原的分离与鉴定实验研究

尚丽元刘 蕾高雪霏

(1.吉林莫莫格国家级自然保护区管理局，吉林白城 132000；2.吉林向海国家级自然保护区管理局，吉林通榆 137215；3.吉林莫莫格国家级自然保护区管理局，吉林白城 132000)

基于丹顶鹤和大鸨病原的分离与鉴定实验研究

尚丽元1刘 蕾2高雪霏3

(1.吉林莫莫格国家级自然保护区管理局，吉林白城 132000；2.吉林向海国家级自然保护区管理局，吉林通榆 137215；3.吉林莫莫格国家级自然保护区管理局，吉林白城 132000)

本文通过对丹顶鹤和大鸨的病例剖检，病毒、细菌的分离和培养、染色镜检、生化鉴定和16SrRNAPCR测定，实验检测结果表明该死亡的丹顶鹤和大鸨因致病性大肠杆菌感染。经过药敏试验筛选得到了复方新诺明为最佳治疗药物，通过三天的饮水给药，大群症状明显得到控制。药敏试验结果表明人工养殖的丹顶鹤比半散养的大鸨体内分离的大肠杆菌耐药普广。

丹顶鹤；大鸨；病例剖检；生化鉴定

1 试验方法

剖检死亡丹顶鹤，可闻到淡淡的特殊臭味，肺脏、小肠粘膜充血出血。死亡大鸨剖检症状不明显。疑似大肠杆菌。取丹顶鹤的脾脏和肝脏等组织，低温研磨充分，制备成1：5组织悬液，离心后取上清液，加双抗（青霉素、链霉素）用0.22μm的滤膜滤过，用注射器经尿囊腔接种9～10日龄的鸡胚，放置于恒温培养箱内孵化24h，照蛋挑出死亡的鸡胚，收集死亡的鸡胚放到4℃冰箱内保存。孵化至第4d，将全部未死亡的鸡胚放到4℃冰箱冷藏4h，收集尿囊液，做血凝试验（HA）。在无菌条件下，将丹顶鹤和大鸨的肝脏和心脏分别各划线接种两个加有犊牛血清的肉汤琼脂培养基上。分别将两组做好标记。第一组培养皿置于37℃恒温培养箱内培养24h。第二组培养皿放置于厌氧罐里置于37℃恒温培养箱内厌氧培养24h。分别挑取1～2个菌落接种到伊红-美兰培养基、麦康凯培养基、三糖铁培养基上，放置于37℃培养箱内培养18～24h后观察菌落的生长情况。涂片革兰氏染色观察，剖检同时将丹顶鹤的心、肝和大鸨的心、肝，在无菌条件下将其新鲜切面在干净的载玻片上压印，自然干燥，火焰固定，革兰氏染色。细菌纯培养，用无菌牙签在麦康凯培养基上挑取单一菌落，经革兰氏染色后，油镜下观察细菌的形态和颜色。再挑去单一菌落在麦康凯琼脂斜面上划线，放入37℃恒温培养箱中，培养12h后，获得纯培养物。然后再挑取纯培养的单一菌落接种在LB液体培养基中，放于37℃恒温摇床内培养12h。培养菌落的LB培养基和挑完菌的麦康凯琼脂平板置于4℃冰箱内保存备用。分离菌株的16SrRNAPCR分子鉴定，在超净台内挑出单个菌落，接种于LB液体培养基内，放置于37℃摇床内培养18h，此菌液作为PCR菌液的模板。将15只昆明鼠随机分成3组，每组5只，第3组为对照组。将从丹顶鹤体内分离后纯培养的菌株经腹腔注射第一组小鼠；将从大鸨体内分离后纯培养的菌株经腹腔注射第二组小鼠，每只小鼠腹腔注射纯培养菌液0.1ml，对照组注射普通肉汤0.1ml，隔离词养。每天观察记录小鼠的精神状态，食欲和临床症状和死亡情况，对死亡小鼠进行剖检观察，并取小鼠肝脏等进行细菌回归试验。按Kirby-Bauer氏法，使用21种药敏纸片对从丹顶鹤和大鸨体内分离出的细菌进行药敏试验。

2 实验结果

2.1 病毒分离结果

接种鸡胚后，孵化到第4d，结果均无死亡，收集尿囊液，经血凝试验，无血凝性。鸡胚的尿囊液盲传了三代，均没有凝血性。排除了感染禽流感病毒和新城疫病毒的可能。电子显微镜下未见到病毒粒子。

2.2 细菌分离鉴定结果

经过不同培养基的分离和纯化培养，在丹顶鹤体内和大鸨体内各分离一株细菌。两株细菌在各培养基的生长情况相似。在血清肉汤培养基上呈现湿润、光滑、灰白色，边缘整齐的菌落，正常培养和厌氧培养下的的菌落，生长状况均良好。在麦康凯培养基上呈桃红色、湿润、光滑、中间凸起、边缘整齐直径约1.5mm的菌落；在伊红-美兰琼脂培养基上呈黑金属光泽的圆形小菌落；三糖铁琼脂斜面培养基产酸产气，斜面和底层均变黄，在液体的LB培养基中，呈均匀浑浊的，管底菌液有沉淀。形态学观察结果，革兰氏染色，镜检可见到革兰氏阴性细菌，散在或成排、两端钝圆，两极浓染，无芽孢的短小杆菌见。生理生化试验结果，丹顶鹤源分离株可以利用麦芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、棉子糖和乳糖并产酸产气，不利用山梨醇、鼠李糖和阿拉伯糖，丹顶鹤源分离株可以利用麦芽糖、甘露糖、蔗糖、葡萄糖、鼠李糖和乳糖并产酸产气，不利用棉子糖和阿拉伯糖，两株菌在山梨醇、棉子糖和鼠李糖的利用有差异。

3 药敏试验结果与耐药性分析

丹顶鹤源和大鸨源分离出的两株大肠杆菌有着明显的药敏差异，丹顶鹤源分离株对氯霉素、庆大霉素、复方新诺明、卡那霉素高敏，对多粘菌素、阿米卡星中度敏感，其余药品均不同程度的耐药包括头孢类、青霉素类、喹诺酮类、四环素类；大鸨源的大肠杆菌除了对多粘菌素、利福平、链霉素、四环素耐药外，对其他药品都有较高的敏感性。试验结果可以看出人工孵化的丹顶鹤体内分离出的致病性大肠杆菌的耐药谱远远高于从半散养状态下大鸨体内分离出的大肠杆菌的耐药谱。丹顶鹤由人工孵化，出壳后一直由人工饲养，出现拉稀、食欲不振的情况下饲养员通常会给与一些预防用药而半散养状态下的大鸨不曾用药。这可能是两株菌的耐药性差异的原因。

4 讨论

本试验中的丹顶鹤由人工繁育，食物基本是鱼类，五月份天气转暖后，鱼容易腐败，雏鹤吃了不新鲜的鱼易发生腹泻，通常会给一定量的抗生素进行预防和治疗。雏鹤的饲养环境常与游客和闲杂人接触，也给疾病传播创造了便利条件。而大鸨在围网内很少接触到外来人员，食物也多来自于环境中的昆虫，所以体内的大肠杆菌的耐药性要比丹顶鹤弱一些。避免疾病的发生最重要因素则是均衡的营养搭配，保证机体矿物质元素的需求，提高自身免疫力。笼养鹤的某些寄生虫性疾病、细菌性疾病的发生与饲养环境有着很大的关系，如住白细胞原虫病、球虫病；大肠杆菌、巴氏杆菌性疾病都是由条件性致病菌引起的，这些疾病的发生与通风不良、饲养密度过大、排泄物清扫不及时、消毒不及时等因素有密切的关系。

[1] 陈浩，吕士成，李春荣，等.丹顶鹤疾病防治的给药途径与技术[J].中国家禽，2006，28（20）：34-35.