补肾中药体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的Meta分析

乔利军，侯凌波，温万鑫，袁龙健，招远祺

(1广东省中医院·广州中医药大学第二附属医院，广州510120；2广州中医药大学)



补肾中药体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的Meta分析

乔利军1，侯凌波2，温万鑫1，袁龙健1，招远祺1

(1广东省中医院·广州中医药大学第二附属医院，广州510120；2广州中医药大学)

摘要：目的系统评价补肾中药体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经样细胞分化的能力。方法 计算机检索PubMed、EMBASE、The Cochrane Library、Ovid、中国生物医学文献、中国知网、万方、维普、全国优秀硕士博士论文数据库从建库至2015年7月有关补肾中药诱导大鼠BMSCs向神经样细胞分化的实验研究，以补肾中药作为诱导剂的为实验组，以空白对照成公认的干细胞神经为诱导剂作为对照组。采用Cochrane Handbook5.1.0对纳入的研究进行质量评价，用RevMan5.3软件进行Meta分析。结果最终纳入12篇文献。与对照组比较，补肾中药能明显提高实验组神经上皮干细胞蛋白[MD=20.68，95% CI(16.55,24.82)，P<0.01]、神经元细胞特异性标志神经丝蛋白[MD=59.98，95% CI(48.80,71.15)，P<0.01]、神经元特异性烯醇化酶[MD=26.64，95% CI(8.08,45.20)，P<0.01]阳性细胞的表达率，降低胶质纤维酸性蛋白[MD=-17.49，95% CI(-33.90,-1.07)，P<0.01]阳性细胞的表达率。结论 补肾中药可以有效地体外诱导大鼠BMSCs分化为神经干细胞(NSCs)，并进一步促进NSCs向神经元分化，抑制NSCs向神经胶质细胞分化。

关键词：补肾中药；骨髓间充质干细胞；神经分化；Meta分析；大鼠

研究发现，骨髓间充质干细胞(BMSCs)无论是体内注射[1]，还是经特殊条件下体外诱导[2]，大部分可分化为神经样细胞，其向神经细胞分化潜能为神经损伤的修复提供了新的干细胞来源。补肾中药具有补肾填精、充养脑髓的作用，对神经系统疾病的治疗疗效显著，以补肾中药作为诱导剂来诱导BMSCs向神经样细胞分化的研究取得一定成效。本研究于2015年7月检索具有补肾功效的任何剂型中药(包括有效成分、单体及复合制剂等)诱导BMSCs向神经样细胞分化的相关资料，系统评价补肾中药诱导BMSCs向神经样细胞分化的能力。

1材料与方法

1.1文献检索策略检索年限从建库至2015年7月。以bone marrow mesenchymal stem cells、bone marrow-derived mesenchymal stem cells、BMSCs、rat、neuron like cells、nerve、neuranagenesis、Chinese herb为英文检索词，以骨髓间充质干细胞、大鼠、神经样细胞、神经分化、中药为中文检索词，补肾中药包括鹿茸、巴戟天、淫羊藿、杜仲、续断、肉苁蓉、补骨脂、锁阳、菟丝子、地黄、枸杞、何首乌、龟板等，参照各中药单体及有效成分英文译名，分别与中英文检索词配合检索，计算机检索PubMed、EMBASE、The Cochrane Library、Ovid、中国生物医学文献数据库、中国知网、万方、维普、全国优秀硕士博士论文数据库。

1.2文献纳入与排除标准纳入标准：①研究对象为大鼠的骨髓间充质干细胞；②采用随机对照设计方案；③实验组采用任何剂型的补肾中药(中药有效成分、单体或复合制剂，主治功效以补肾填精为主)作为诱导剂，对照组为空白对照或公认的干细胞神经诱导剂，诱导方法、诱导时间不限。排除标准：①大鼠骨髓来源以外的其他类型的间充质干细胞，如人骨髓间充质干细胞、小鼠骨髓间充质干细胞、羊骨髓间充质干细胞等；②未提供原始数据或资料不完整；③重复发表的研究。

1.3观察指标反映神经样细胞增殖、分化的指标，如神经上皮干细胞蛋白(Nestin)、神经元细胞特异性标志神经丝蛋白(NF)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。

1.4资料提取由两位评价人员各自独立提取资料，有意见分歧时讨论解决，必要时与第三方讨论确定。使用Endnote X6管理文献，合并检索结果并剔除重复文献，通过阅读题目及摘要排除明显不相关文献，再阅读全文进一步筛选出符合纳入与排除标准的文献。用Excel2010软件制定资料提取表，提取内容包括：题目、作者姓名、发表日期、文献来源、研究方法、实验组和对照组的干预措施、结局指标及结果等。实验组数据涉及不同剂量者，以高浓度组数据为最终提取数据。文献中未提供的数据，通过与文献作者联系获取。

1.5文献质量评价对纳入的原始研究进行方法学质量评价。评价标准参照Cochrane Handbook5.1.0及相关文献[3]，包括研究目的、研究分组、研究方法、数据分析、结果评价五部分内容。评价结果分为三个等级，Ⅰ级：所有5条质量评价标准均完全满足且方法正确，则该研究存在各种偏倚的可能性小；Ⅱ级：如果其中任一条为部分满足(不清楚)，则该研究存在相应偏倚的中等程度可能性；Ⅲ级：只要其中任一条评价标准未做，则该研究存在高度偏倚的可能性。

1.6统计学方法采用RevMan5.3软件进行Meta分析。对计量资料，测量方式与表达相同时采用均数差(MD)，测量尺度不同或者研究间结果变量高度不一致时采用标准化均数差。各效应量均以点估计和95%可信区间(95%CI)表达；用Q检验估计是否存在异质性(检验水平为α=0.1)。采用I2对异质性进行定量分析(检验水平为50%)。当各研究间无临床异质性但有统计学同质性时(P>0.1，I2<50%)，采用固定效应模型进行Meta分析；当各研究间存在统计学异质性时(P≤0.1，I2>50%)，分析其异质性来源，进行亚组分析；当各研究组存在统计学异质性而无临床异质性时，采用随机效应模型进行分析，并作敏感性分析检验结果的可靠性；如果研究数据不能进行Meta分析时，则只对其进行描述性分析。

2结果

2.1纳入文献的基本资料共检索出文献514篇，均为中文文献，符合纳入标准的12篇[4~15]。12篇文献中涉及5类具有补肾功效的中药单体(地黄多糖[6，7]、枸杞多糖[8，9]、鹿茸精[11]、鹿茸多肽[12]、肉苁蓉总苷[14])、2类单味中药(龟板[4,13]、锁阳[15])、2类复方制剂(补肾益脑胶囊[5]、三甲复脉汤[10])。纳入的12篇文献中Ⅰ级2篇[6，15]、Ⅱ级7篇[4，7~10，13，14]、Ⅲ级3篇[5，11，12]。3篇文献[5,11,12]对照组的结果仅描述为阴性。

2.2补肾中药诱导BMSCs增殖的效应5篇研究[4,6，8，14，15]报告了Nestin的表达情况，其研究结果有异质性(P<0.01，I2=96%)，采用随机效应模型分析结果显示，两组差异有统计学意义[MD=20.68，95%CI(16.55,24.82)，P<0.01]，表明相对于对照组，补肾中药能显著提高Nestin阳性细胞的表达率。

2.3补肾中药诱导BMSCs向神经元分化的效应8篇研究[5,7~13]报告了NF的表达情况，但其中3篇研究[5，11，12]对照组结果均仅描述为表达阴性，未获得具体数据，未能纳入Meta分析。对另外5篇研究采用随机效应模型分析(P<0.01，I2=98%)，结果显示补肾中药能显著提高NF阳性细胞表达率[MD=59.98，95%CI(48.80,71.15)，P<0.01]。另有3篇研究[6，14，15]以NSE作为神经元标记物，并报告了其表达情况，其研究结果间有异质性(P<0.01，I2=100%)，采用随机效应模型分析，结果显示两组差异有统计学意义[MD=26.64，95%CI(8.08,45.20)，P<0.01]，表明相对于对照组，补肾中药能显著提高NSE阳性细胞表达率。

2.4补肾中药诱导BMSCs向神经胶质细胞分化的效应11篇研究[4~13，15]以GFAP作为BMSCs向神经胶质细胞分化的观测指标，但其中8篇研究[4，5，8-13]均报告为GFAP阴性表达，未提供具体数据，仅3篇研究[6，7，15]最终纳入Meta分析。各研究间有异质性(P<0.01，I2=100%)，采用随机效应模型分析，结果显示补肾中药明显降低GFAP阳性细胞表达率[MD=-17.49，95%CI(-33.90,-1.07)，P<0.01]。

3讨论

BMSCs是从骨髓中提取的成体干细胞，具有高度自我更新能力及跨胚层多向分化潜能。细胞因子、细胞共培养、核酸及衍生物和中药及其提纯物是最常用于诱导BMSCs向神经样细胞分化的方法[16]，诱导方法的不同导致BMSCs在体外分化成神样经细胞的比例也不一样。细胞的增殖和分化受各种细胞因子及细胞微环境的影响，并有多种核酸及衍生物参与其信号转导过程，然而BMSCs向神经元样细胞分化的比例仍然较低。中医药治疗强调整体观念，中药或可直接作用于干细胞，促进其增殖、分化，或可影响干细胞所处的微环境，促进其存活与功能建立，或可调整机体免疫，减轻免疫排斥反应，研究证实多种中药可以诱导BMSCs分化为神经样细胞。

本研究采用系统评价和Meta分析的方法，从神经干细胞(NSCs)增殖、神经元与神经胶质细胞分化等方面评估了补肾中药诱导BMSCs向神经样细胞分化的能力，研究结果显示：与对照组相比，补肾中药诱导BMSCs分化为NSCs，并进一步促进NSCs向神经元分化，抑制NSCs向神经胶质细胞分化。

补肾填精益髓是建立在中医辨证论治理论下中枢神经系统疾病的重要治则之一，因此补肾中药对中枢神经系统疾病的作用也日益受到研究者的重视[17]。《黄帝内经》对脑的生成做了准确描述，《灵枢·经脉》曰“人始生，先成精，精成而脑髓生”。肾者，主藏精，主骨生髓。《医学衷中参西录·医论》“脑为髓海，乃聚髓处，非生髓之处，究其本源，实由肾中真阴真阳之气，酝酿化合而成，缘督脉上升而贯注于脑”，说明肾精为脑的发生、形成提供了物质基础。若肾精不足，髓海空虚，则“脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧”(《灵枢·海论》)。随着NSCs研究的深入及中医学“肾精”学说的发展，肾精与NSCs之间有着非常密切的关系，肾精生髓充脑的作用可能是通过NSCs实现的[18]。BMSCs来源于骨髓，它既具有精、髓、血的特性，又有化生其他物质的功能，因而采用补肾填精益髓法促进其向神经样细胞分化具有可行性。

本研究所纳入的文献是基于细胞实验的基础研究，无规范的实验设计和质量评价标准，加之纳入的文献均为非盲法检测，结果可能出现测量性偏倚。纳入文献的质量，大多为Ⅱ级，存在高度偏倚可能，评价结论仅供参考。在本研究的Meta分析中，虽已对各研究指标(Nestin、NF、NSE及GFAP)进行亚组分析，但各组内仍存在较大的异质性，详细阅读各研究的实验方案，笔者认为补肾中药品种的不同或许是异质性产生的最主要原因，而BMSCs来源、培养与扩增时所选用的培养基、传代数目、补肾中药诱导时间、补肾中药诱导剂量等影响因素同样可导致实验的异质性，可能会对实验结果有一定影响，亦是今后需要深入研究的难点。另外，本研究所纳入的文献均是基于细胞实验的基础研究，由于基础研究的自身特殊性，目前尚缺乏规范的细胞实验Meta 分析的方法学研究，建立并不断完善细胞实验研究文献检索和质量评价体系，规范细胞实验研究的实验设计，增强其科学性、实用性及与临床研究的可比性是目前亟待解决的问题。

现有研究表明，补肾中药可以有效地体外诱导BMSCs分化为NSCs，并进一步促进NSCs向神经元分化，抑制NSCs向神经胶质细胞分化，对进一步开展在体动物实验研究及临床研究有指导意义。但受纳入研究质量所限，本研究结论尚需更多高质量的研究加以验证。

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(收稿日期：2015-11-11)

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)09-0026-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.009

通信作者：招远祺(E-mail:tcm2008@126.com)

基金项目：广东省自然科学基金资助项目(2015A030310436)；广东省中医药管理局科研项目(20151210)。