混合均匀设计法优选金樱子半仿生提取工艺

2016-04-05赵惠茹

中成药 2016年1期

关键词：金樱子

赵惠茹，刘敏

（西安医学院药学院，陕西西安710021）

混合均匀设计法优选金樱子半仿生提取工艺

赵惠茹，刘敏

（西安医学院药学院，陕西西安710021）

摘要：目的优选半仿生法提取金樱子的最佳工艺条件。方法以3次煎煮用水的pH值和煎煮时间为考察因素，总黄酮、多糖、干浸膏得率为指标，应用混合均匀设计法优选金樱子半仿生提取的最佳工艺参数。结果金樱子半仿生提取最佳工艺为3次煎煮用水的pH依次为5、7.5、9，时间分别为2、1、1 h。结论该工艺合理可行，可用于金樱子的提取。

关键词：金樱子；半仿生提取；混合均匀设计

金樱子又名刺榆子、糖刺果、刺橄榄等，为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michx.的成熟果实，味酸、甘、涩［1］。现代药理研究表明［2］，金樱子果实可作为利尿剂、镇咳剂，也常用于高血压、慢性肾炎、烧烫伤、神经衰弱等疾病的治疗。作为药食同源的植物之一，金樱子含有多糖、黄酮、酚酸、甾体、三萜类化合物等生物活性成分，其中多糖和黄酮类物质的含有量较高［3］。关于金樱子多糖、黄酮类化合物提取的研究报道较多，大多采用正交试验设计，以热水浸提多糖、含水乙醇提取黄酮、酶化、超声波、微波等方法同时提取这两类成分［4-7］，但当试验中的因素和水平较多时，正交设计所需的试验次数也较多，并且这些提取方法均未考虑到药物在胃肠道的吸收情况。因此，本实验采用可以提高药物生物利用度的半仿生提取法［8-9］，依次用不同pH的酸水和碱水进行提取，主要考察pH值及提取时间对金樱子中多糖和黄酮类物质的影响。在试验设计方面，均匀设计特别适用于多因素多水平的试验设计，可用多重线性回归分析方法准确、迅速地分析数据。到目前为止，采用混合均匀设计法优选金樱子的半仿生提取工艺尚未见报道，因此本实验的目的在于为金樱子的提取提供一条可参考的工艺路线，使其在药食两用领域的开发前景更加广阔。

1 仪器与材料

1.1 仪器 PHS-3C型精密pH酸度计（上海精密科学仪器有限公司）；UV-160A紫外分光光度计（日本岛津公司）；KQ5200E型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；FA1004B型电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；RE-201L旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；DZKW-D-2电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；DHG-9240B电热恒温鼓风干燥箱（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 材料 D-无水葡萄糖（批号110833-200904）、芦丁（批号100080-200707）对照品（中国食品药品检定研究院）。金樱子购于西安市万寿路药材市场，并由边军昌高级实验师鉴定为蔷薇科植物金樱子Rosa laevlgata Michx的干燥成熟果实。水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 试验设计根据半仿生法提取的原理，将金樱子粗粉先用酸水提取，然后用碱水提取，模拟口服给药及药物经胃肠道转运的过程，以金樱子总黄酮、多糖和干浸膏得率为指标，在药材粒度（过40目筛）、提取温度（100℃）、提取次数（3次）、过滤、浓缩等条件相同的情况下，确定3次煎煮用水的pH值和总时间为主要因素，各因素选取不同的水平，试验设计见表1。

表1　U9（91×33）试验设计

2.2 总黄酮含有量测定［10］

2.2.1 芦丁对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品

21.4 mg，加适量无水乙醇溶解，定容于50 mL量瓶中，摇匀，得质量浓度为0.428 mg/mL的对照品贮备液。精密吸取5 mL，置于25 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得质量浓度为85.6 μg/mL芦丁对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备及样品中总黄酮含有量的测定将金樱子果实干燥，碾碎，过40目筛，置于索氏提取器中，用石油醚回流提取至无色，药渣干燥至恒重。精密称取脱脂后干燥的金樱子粉末约5 g，按表1方法进行试验，每份样品煎煮3次（料液比依次为12、8、6倍，3次提取时间比为2∶1∶1），提取液用4层纱布加100目筛分别滤过，3 000 r/min离心15 min，合并上清液，浓缩并定容至100 m L量瓶中，即得样品溶液。取20 m L置于蒸发皿中，水浴蒸至近干，105℃下烘干，研匀，加80％乙醇15 mL，超声提取30 min，滤过，定容于25 mL量瓶中，即得总黄酮的供试品溶液。精密吸取该溶液适量，加水逐级稀释并定容于适当体积的量瓶中，再精密吸取此样品溶液适量，置于10 mL量瓶中，测定金樱子中总黄酮的含有量。

2.2.3 标准曲线的制备与线性关系考察精密吸取芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，依次加入5％亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min，加入10％三氯化铝溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min，再加入4％氢氧化钠溶液4 mL，用水稀释至刻度，摇匀，放置15 min，在508 nm处测定吸光度。以对照品溶液质量浓度为横坐标（C），吸光度为纵坐标（A）绘制标准曲线，得回归方程A=0.016 2C+0.010 4（r=0.999 7），表明芦丁在8.56～42.8 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.4 精密度试验精密吸取质量浓度为85.6 μg/mL的芦丁对照品溶液3.0 mL，按“2.2.3”项下方法连续测定6次吸光度，计算出RSD值为0.26％（n =6），表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验取供试品溶液适量，按“2.2.3”项下方法操作，分别在0、2、4、6、8 h测定吸光度，计算出RSD值为1.78％（n =5），表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.2.6 重复性试验取同一批金樱子果实6份，按“2.2.2”项下方法制备样品，按照表1中的7号试验条件进行提取，“2.2.3”项下方法测定，计算含有量。结果，样品中总黄酮含有量分别为35.9、36.3、37.2、37.8、36.9、35.1 mg/g，平均36.5 mg/g，RSD值为2.63％（n = 6），表明该方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验精密称取经石油醚脱脂、干燥至恒重、含有量已知的金樱子粉末0.1 g，共9份，分别精密加入80％、100％、120％的芦丁对照品各3份，按“2.2.2”项下方法制备样品，按照表1中的7号试验条件进行提取，“2.2.3”项下方法测定含有量。结果，平均回收率为96.89％，RSD为1.82％（n =9），表明该方法可行，准确性好。

2.3 多糖含有量测定［11-12］

2.3.1 葡萄糖对照品溶液的制备精密称取葡萄糖对照品26.91 mg，加适量蒸馏水溶解，定容于10 mL量瓶中，摇匀，得质量浓度为2.691 0 mg/mL的葡萄糖对照品贮备液，精密吸取2.5 mL于25 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.269 1 mg/m L的葡萄糖对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备及样品中多糖含有量测定精密吸取“2.2.2”项下3次水煎煮后的样品溶液5 mL，加水稀释，定容于量瓶中。再往3次水提后的残渣中加水15 mL，置沸水浴中加热回流30 min，趁热过滤，残渣用热水洗涤，合并滤液，冷却至室温，转移至25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密吸取以上两种样品溶液适量，分别置于10 mL量瓶中，按照“2.3.3”项下方法测定其含有量，两者之和即为总多糖的含有量，见表2。

表2　各指标成分含有量及标准化处理结果

2.3.3 标准曲线的制备与线性关系考察精密量取对照品溶液0.0、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6 m L，分别置于10 mL量瓶中，加纯水稀释至刻度，摇匀，分别吸取1 mL，置于对应编号的试管中，加6％苯酚1 mL、浓硫酸5 mL，摇匀，40℃水浴中保温30 min，取出冷却至室温，在490 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标（A），质量浓度为横坐标（C）绘制标准曲线，得回归方程A=0.011 0C+0.000 1（r=0.999 7）。结果表明，葡萄糖在16.15～69.96 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.4 精密度试验精密吸取葡萄糖对照品溶液1 mL，稀释10倍，吸取1 mL置于试管中，苯酚-浓硫酸法显色后，在490 nm处连续测定6次吸光度。结果，RSD值为0.17％（n =6），表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验精密吸取多糖供试品溶液2.2 mL，稀释10倍，精密吸取1 m L置于试管中，苯酚-浓硫酸法显色后，在0、2、4、6、8 h，490 nm处测定吸光度。结果，RSD值为2.92％（n =5），表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.3.6 重复性试验精密称取脱脂后的样品6份，按照表1中的7号试验条件进行提取，按“2.3.2”项下方法制备多糖供试品溶液，分别精密吸取1 mL，稀释100倍，按“2.3.3”项下方法测定吸光度，并计算含有量。结果，多糖的RSD值为1.94％（n =6），表明该方法重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验精密称取经石油醚脱脂、干燥至恒重、含有量已知的金樱子粉末0.1 g，共9份，分别精密加入80％、100％、120％的葡萄糖对照品各3份，按照表1中的7号试验条件进行提取，按“2.3.2”项下方法制备多糖供试品溶液，“2.3.3”项下方法测定所得多糖含有量之和。结果，平均回收率为97.34％，RSD为1.56％（n =9），表明该方法可行，准确性好。

2.4 干浸膏得率的测定精密吸取“2.2.2”项下样品溶液各20 mL，置于恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃下烘至恒重，计算干浸膏得率。

2.5 试验结果与标准化处理按照试验建立的总黄酮、总多糖、干浸膏得率计算方法，测定每份样品中这3个指标的数据，按公式Xij=（Xij-Xj）/Sj进行标准化处理（Xij为样品液i中成分j的含有量；Xj为9个水平样品液i中成分j的平均值；Sj为成分j的标准偏差；Xij为标准化后的值［13］）。根据各指标在提取工艺中的主次地位，给予不同的加权系数，Y=总黄酮含有量×4 +总多糖含有量×4 +干浸膏得率×2。以标准化后的值（表2中括号内的数字）加权后求和，即得综合评价指标Y值，结果见表2。

2.6 多元回归方程的建立将Y（综合评价指标）用DPS 7.05软件进行二次多项式逐步非线性回归分析，得回归方程Y=309.985 +168.174B-223.617C-0.522 381A2+ 20.780 6C2+0.435 729AB+0.590 236AD-18.499 4BC，r=0.999 9，F（7，1）=595.716 9。查F值表，F0.05（7，1）= 236.8，F＞F0.05（7，1）（P＜0.05）。F检验表明，回归方程在a=0.05水平上有显著意义；剩余标准差S =0.213 2，决定系数=0.999 7，说明此回归方程具有良好的预测精度。数据模型因素的相关性分析见表3。

由表3可知，各因素对综合评价指标的影响程度为B= B×C＞C2＞A×D=C＞A2＞A×B，即第二煎pH值、第三煎pH值、第一煎pH值的二次项、第三煎pH值的二次项、第一煎pH值分别与第二煎pH值和提取时间的交互项、第二煎pH值与第三煎pH值的交互项均有显著性影响。然后，应用DPS 7.05软件将方程进行优化，以综合评价指标的期望值大者为佳，得优化条件为A=5.1，B=7.5，C= 9，D=4，预测Y值为8.425。结合生产实际，确定金樱子半仿生提取的最佳工艺，即三煎用水的pH分别为5.0、7.5、9.0，分别加12、8、6倍量水，煎煮时间分别为2、1、1 h。

表3　数据模型因素的相关性分析

2.7 验证试验按照优化的工艺条件，依据“2.2”～“2.5”项下样品的制备和测定方法，进行3次验证性试验，测得各指标成分含有量，并将结果进行标准化处理。结果，总黄酮平均含有量为45.8 mg/g，总多糖平均含有量为303.52 mg/g，干浸膏得率平均值为38.06％，综合评价指标Y′为8.262，与预测值（Y=8.425）比较接近，说明该提取工艺稳定可行。

3 讨论

由于金樱子以黄棕至红棕色的果实入药，含有大量的脂类及脂溶性色素，而本实验采用紫外可见分光光度法测定总黄酮和总多糖的含有量，为了使显色反应更加灵敏，专属性更强，在提取前药材用石油醚连续回流提取，使脱脂更完全。

在本实验的操作过程中，用于测定多糖含有量的样品包括两部分，一部分来源于不同pH值提取的3次水煎液，而另一部分是由提取过黄酮的药渣继续用中性水提取得到。结果表明，第二部分所得多糖的含有量仅为第一部分的1.5％～3.8％，而金樱子多糖的含有量非常高，故为了提高工作效率，可以省去药渣的再次提取。

表1的试验设计是用pH值依次增大的蒸馏水连续3次煎煮药材，这是由于人体胃、小肠、大肠的体液pH值分别为1.5～2.0、7.6、8.4，体现了半仿生提取法的特点。但根据实际情况，第二次和第三次煎煮的pH值以及时间在合理的范围内细分为9个水平意义不大，故第一次煎煮的pH值设置了9个水平，而第二次和第三次煎煮的pH值以及时间只设置了3个水平。由此，在选择均匀设计表时采用了U9（91×33）混合均匀设计表来安排试验，可使试验次数明显减少，效率显著提高。

用混合均匀设计法优选金樱子半仿生提取工艺时，由于本实验选用的总黄酮、总多糖和干浸膏得率等指标在提取工艺中的主次地位不同，因此在进行数据处理时，分别给予它们不同的权重系数，将实验数据进行标准化处理，得到综合评价指标［14-15］。这样，就可以消除各指标之间单位和量纲的不同，使实验结果更加合理科学。

参考文献：

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