大七气汤单用及联合顺铂对SKOV-3细胞移植瘤Survivin与Caspase-3表达的影响

2016-04-05杨洋博君，李舒，王爽，陈蓉

中成药 2016年1期

关键词：荷瘤卵巢癌低剂量

杨　洋　博　君，李舒，王爽，陈蓉

（1.重庆医科大学中医药学院，重庆400016；2.重庆医科大学中医药研究室，重庆400016）

大七气汤单用及联合顺铂对SKOV-3细胞移植瘤Survivin与Caspase-3表达的影响

杨洋博君1，李舒1，王爽1，陈蓉2*

（1.重庆医科大学中医药学院，重庆400016；2.重庆医科大学中医药研究室，重庆400016）

摘要：目的探讨大七气汤加减方（姜黄、三棱、莪术、半枝莲等）单用及联合顺铂对SKOV-3细胞移植瘤Survivin 与Caspase-3表达的影响。方法将SKOV-3细胞移植瘤造模成功的40只荷瘤鼠随机分为模型对照组、大七气汤低、高剂量组、顺铂组、顺铂联合大七气汤组，每组8只，给药21 d后处死所有荷瘤鼠，称瘤重，测瘤体积，以逆转录-聚合酶链反应法和蛋白质印迹法检测瘤组织Survivin、Caspase-3 mRNA及蛋白的表达。结果各用药组瘤重和瘤体积均小于模型对照组（P＜0.01）；逆转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测结果显示中药组Survivin mRNA及蛋白表达明显低于模型对照组（P＜0.01），且大七气汤低剂量组与DDP顺铂组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且DDP联合大七气汤组表达最低；用药组Caspase-3 mRNA和蛋白表达明显高于模型对照组（P＜0.01），且大七气汤低剂量组与顺铂组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且顺铂联合大七气汤组表达最高。结论大七气汤加减方能够下调Survivin和上调Caspase-3的表达来达到抑制肿瘤细胞生长和促进肿瘤细胞凋亡，且大七气汤联合顺铂对SKOV-3细胞移植瘤治疗具有增效作用。

关键词：大七气汤；顺铂；人卵巢癌细胞株SKOV-3；Survivin；Caspase-3

Effects of single Daqiqi Decoction and combined w ith DDP on Survivin and Caspase-3 expressions of SKOV-3 cell transplanted tumor

YANG Yang-bo-jun1， LIShu1， WANG Shuang1， CHEN Rong2*
（1.College of TCM，Chongqing Medical University，Chongqing 4OOO16，China；2.Institute of TCM，Chongqing Medical University，Chongqing 4OOO16，China）

ABSTRACT：AIM To exp1ore the effects of sing1emodified DaqiqiDecoction（Rhizoma curcumae 1ongae，Sparganii Rhizoma，Curcumae Rhizoma，Scutellariae barbatae Herba，etc.）and combined with DDP on Survivin and Caspase-3 expressions of human ovarian cancer ce111ine SKOV-3.METHODS A mode1 of SKOV-3 ce11 transp1anted tumor was estab1ished and fortymice with tumor were divided intomode1 contro1group，Daqiqi Decoction 1ow-，high-dose groups，DDP group and DDP combined with Daqiqi Decoction group，eightmice in each group. After successive administration for 21 d，the weights of tumor and vo1ume weremeasured，and the expressions of Survivin，Caspase-3 mRNA and protein were detected by reverse transcription po1ymerase chain reaction（PCR）and Western b1otmethod.RESULTS Each group's tumor weight and vo1ume were 1ess than those of themode1 contro1group（P＜0.01）.The detection resu1ts of reverse transcription PCR and Western b1ot showed that the expressions of Survivin mRNA and protein in treatment groupswere significant1y 1ower than those of themode1group （P＜0.01）.There was no statistica1difference as compared with the DDP group（P＜0.05），the DDP combined with the Daqiqi Decoction group was the 1owest，and the expressions of Caspase-3 mRNA and protein in the test group were significant1y higher than those in the mode1group（P＜0.01）.There was no statistica1 difference as compared with the DDP group（P＞0.05），and the DDP combined with Daqiqi Decoction group was the highest. CONCLUSION Themodified Daqiqi Decoction can achieve the inhibition of tumor ce11growth and promotion of apoptosis of tumor ce11s by reducing the expression of Survivin and raising the expression of Caspase-3.It a1so has synergistic effect in the combination with DDP on SKOV-3 ce11 transp1antation tumor.

KEY WORDS：Daqiqi Decoction；DDP（cis-dich1orodiaminep1atinum）；human ovarian cacer ce11 1ine SKOV-3；Survivin；Caspase-3

卵巢癌是女性生殖系统中死亡率最高的恶性肿瘤之一［1］。化学药物治疗是目前卵巢癌治疗的重要手段［2］，其主要通过抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用；而由凋亡相关基因调控的细胞凋亡是肿瘤细胞死亡的主要方式，因此通过检测凋亡相关基因表达是判断卵巢癌治疗是否有效的重要标准之一。顺铂（cis-dich1orodiaminep1atinum，DDP）作为第一代的铂类抗肿瘤药物，是卵巢癌一线标准化疗方案用药，其具有作用强、活性高、广泛抗肿瘤的特点；但化疗药物所产生耐药性、敏感性降低和毒副作用直接导致了治疗中后期的无效和预后不良［3］。因此，只有研究如何增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、减轻毒副作用，制定合理有效的综合治疗方案才能提高生存率和延长生存期。

大七气汤是《医宗金鉴》中的抗癌经方，我们在临床运用其加减方辅助顺铂治疗卵巢癌患者得到了较好的反馈，具有增效减毒作用，故探讨其作用机制十分迫切。本研究通过建立裸鼠SKOV-3细胞皮下移植瘤模型进行体内实验，通过测量各组荷瘤鼠瘤体积、瘤重，并检测肿瘤组织中Survivin和Caspase-3 mRNA和蛋白量的表达，从而进一步研究大七气汤加减方对卵巢癌SKOV-3细胞移植瘤的影响，观察大七气汤加减方在人卵巢癌移植瘤裸鼠中的抗肿瘤作用和作用机制，为临床治疗该恶性肿瘤寻找更有效的药物。

1 材料

1.1 实验动物 BALB/c裸鼠，雌性，4～6周龄，体质量（16±2）g，购于重庆医科大学动物实验中心，生产许可证号SCXK（渝）2012-0002，饲养于恒湿（40％～60％）、恒温（22～26℃）的独立换气净化笼（individua11y venti1ated cages，IVC）中，裸鼠标准饲料、饮用水、垫料等一切与鼠接触物品均经高压灭菌处理。裸鼠适应性喂养1周后开始进行实验。

1.2 实验药物、试剂大七气汤加减方主要组成有姜黄、三棱、莪术、半枝莲、陈皮、青皮、桔梗、半夏、藿香、木香、益智仁、肉桂、炙甘草等，购于重庆医科大学附属第一医院中药房（所有药材均由重庆医科大学中医药研究室何先元教授鉴定），实验前制备1 g/mL汤剂，高压灭菌后4℃冰箱备用。RPMI-1640培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶（EDTA）均购自美国Hyc1one公司，二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。0.9％氯化钠注射液购于湖南康源制药有限公司，注射用顺铂购于齐鲁制药有限公司。RNA提取试剂盒、反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购于日本TaKaRa公司，兔抗人Survivin、Caspase-3单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

2 方法

2.1 细胞培养及动物模型建立实验细胞人卵巢癌浆液性乳头状囊腺癌SKOV-3细胞株购于美国物种保存中心（american type cu1ture co11ection，ATCC），细胞培养严格无菌操作，培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中并置于5％ CO2、37℃条件下的培养箱内孵育。裸鼠皮下接种实验在IVC动物房超净工作台内进行，收集对数生长期细胞，调整细胞密度至3×107细胞/mL，以0.2 mL/只（约含6×106个细胞）于右大腿外侧皮下接种，接种后可见皮下出现一半球形突起。接种造模成功率为100％。

2.2 实验分组与给药将造模成功的40只荷瘤鼠按照随机数字表法［4］分为模型对照组、大七气汤低剂量组、大七气汤高剂量组、顺铂组、顺铂联合大七气汤组。给药剂量根据《药理实验方法学》［5］制定，大七气汤低剂量组中药灌胃剂量为12 g/（kg.d），高剂量组中药灌胃剂量为24 g/（kg.d），0.2 mL/10 g，模型对照组以等量生理盐水灌胃，顺铂组腹腔注射3 mg/（kg.d）顺铂，顺铂联合大七气汤组为腹腔注射顺铂3 mg/（kg. d）联合大七气汤灌胃12 g/（kg.d）。大七盐水灌胃每天1次，连续21 d；顺铂腹腔注射隔天注射1次，连续7次。

2.3 标本采集与检测于停止给药后第2天进行标本采集，1％戊巴比妥腹腔麻醉后取出各皮下卵巢癌移植瘤组织于液氮罐中保存待测。

2.3.1 观察荷瘤鼠一般状态及肿瘤情况给药期间，每日观察荷瘤鼠的饮食、精神状态及肿瘤生长情况；每3日称体质量并用游标卡尺分别测量瘤体的最长径（a）和最短径（b），计算肿瘤体积（依据公式V=1/2ab2），绘制肿瘤生长曲线，观察肿瘤生长情况；肿瘤组织取出后称瘤重并按照公式计算抑瘤率，抑瘤率（％）=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100％。

2.3.2 逆转录-聚合酶链反应法检测Survivin和Caspase-3 mRNA的表达瘤组织经匀浆、Trizo1裂解、提取瘤组织总RNA后逆转录成cDNA，进行RT-PCR。引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成，Survivin正向为5′-TCCGTGTCCTCGTCCTCCTAC-3′，反向为5′-CGCTGCCCAGGCTGTAGG-3′，扩增长度为219 bp；Caspase-3正向为5′-TTTTTCAGAGGGGATCGTTGTAG-3′，反向为5′-GCATGGCACAAAGCGACTGG-3′，扩增长度为244 bp；Gapdh正向：5′-AGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTC-3′，反向：5′-GCCCCGGCATCGAAGGTGGAAG-3′，扩增长度为725 bp。RT-PCR反应条件为94℃3 min，94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，30个循环，72℃延伸5 min，所得产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳成像扫描，Quantity one软件对图像进行分析，分别以Survivin/Gapdh和Caspase-3/Gapdh的灰度值比值来代表mRNA的相对表达水平。

2.3.3 蛋白质印迹法检测Survivin和Caspase-3蛋白量的表达提取移植瘤组织标本蛋白，BCA法分析测定蛋白质水平；将蛋白进行SDS-PAGE电泳并转移到硝酸纤维素（NC）膜上，5％脱脂奶粉封闭2 h后，分别加入稀释的兔抗人Survivin、Caspase-3单克隆抗体，ECL发光试剂盒进行显色、曝光，凝胶成像系统对胶片进行扫描处理分析。

3 结果

3.1 荷瘤鼠一般情况、瘤重及瘤体积 SKOV-3细胞接种8 d后，裸鼠接种处皮下出现质地较硬的球状突起。接种后观察荷瘤鼠，模型对照组荷瘤鼠精神状态与活动情况欠佳，体质量减轻速度较快，用药组精神状态与活动情况均较良好，体质量维持较好。各用药组瘤重与模型对照组比较均有减轻（P＜0.01）；其中顺铂组瘤重较大七气汤低剂量、高剂量组低，组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）；顺铂联合大七气汤组瘤重最低，与其他治疗组经组间比较差异有统计意义（P＜0.01）。见表1。

表1　各组荷瘤鼠瘤重和抑瘤率（n=8，±s）Tab.1 Each group of tumor weight and inhibitory rate （n=8，±s）

注：与模型对照组比较，*P＜0.01；与顺铂组比较，#P＜0.01；与顺铂联合大七气汤组比较，△P＜0.01

组别　　平均瘤/mg　　抑瘤率/％模型对照组　805.63±47.63#△-55.07大七气汤低剂量组　636.75±43.36*#△　20.96大七气汤高剂量组　491.13±33.52*#△　39.04顺铂组　423.88±34.68*△　47.39顺铂+大七气汤组　362.00±32.71*#

根据肿瘤生长曲线显示，从接种之日起到第14天，肿瘤生长速度相当，之后呈现不同生长趋势，其中模型对照组瘤体积增长速度最快，稍后依次为大七气汤低剂量组、大七气汤高剂量组、顺铂组、顺铂联合大七气汤组；治疗末次各治疗组瘤体积标准差分别是模型对照组45.861，大七气汤低剂量组21.758，大七气汤高剂量组24.798，顺铂组13.999，顺铂+大七气汤组13.988，治疗末次各治疗组瘤体积与模型对照组相比较均减小（P＜0.01），大七气汤高剂量组、顺铂组、顺铂联合大七气汤组经组间比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1　肿瘤生长曲线图Fig.1 Tumor grow th curves

3.2 Survivin、Caspase-3 mRNA在各组中的表达情况 RT-PCR结果显示，与模型对照组比较，各用药组Survivin mRNA表达降低，而Caspase-3 mRNA表达增高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。顺铂联合大七气汤组的Survivin mRNA表达最低，Caspase-3 mRNA表达最高，与大七气汤低剂量组及顺铂组比较差异具有统计学意义（P＜0.01），见图2、图3。

M.标准 1.模型对照组 2.大七气汤低剂量组 3.大七气汤高剂量组 4.顺铂组 5.顺铂+大七气汤组M.standard 1.mode1 contro1 group 2.Daqiqi Decoction group （1ow dose） 3.Daqiqi Decoction group（high dose）4.DDP group 5.DDP+Daqiqi Decoction group图2　Survivin m RNA在各组肿瘤组织的表达Fig.2 mRNA expressions of Survivin in tumor tissues

图3　Caspase-3 mRNA在各组肿瘤组织的表达Fig.3 mRNA expressions of Caspase-3 in tumor tissues

3.3 Survivin、Caspase-3蛋白在各组中的表达情况

Western b1ot结果显示，模型对照组肿瘤组织中Survivin蛋白表达明显高于各治疗组（P＜0.01）；各治疗组间，顺铂联合中药组Survivin蛋白表达量最低，与其余各组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；大七气汤高剂量组与顺铂组Survivin蛋白表达量相比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型对照组肿瘤组织中Caspase-3蛋白表达量明显低于各治疗组（P＜0.01）；各治疗组间，顺铂联合大七气汤组Caspase-3蛋白表达量最高，与其余各组相比较差异有统计学意义（P＜0.05）；大七气汤高剂量组与顺铂组Caspase-3蛋白表达量相比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图4、图5。

图4　Survivin蛋白在各组肿瘤组织的表达Fig.4 Protein expressions of Survivin in tumor tissues

图5　Caspase-3蛋白在各组肿瘤组织的表达Fig.5 Protein expressions of Caspase-3 in tumor tissues

4 讨论

凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）是一类重要的抗细胞凋亡因子，其中Survivin是目前为止发现的最强凋亡抑制因子，具有抑制细胞凋亡和调节细胞增殖的双重功能，并且其高表达与肿瘤预后密切相关，主要通过抑制Caspase-3、9等酶的活性而发挥阻断凋亡的作用［6］。Cohen等对Survivin在卵巢癌中的表达及相关性进行分析，发现Survivin基因的表达与卵巢癌的发生、演变及化疗耐药相关［7］。Caspase是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的凋亡执行蛋白，其中Caspase-3在各种原因导致的细胞凋亡中起着不可替代的作用，Caspase-3活性增加是细胞凋亡的重要机制，而它的失活或表达异常与多种肿瘤的发生发展有关［8］。

大七气汤加减方具有理气活血化瘀、软坚散结解毒之功效。其中姜黄破血行气，通经止痛；近年研究发现，姜黄素可以抑制肿瘤细胞生长和诱导其凋亡［9］；三棱、莪术具有破血消积之效，临床上常相需而用；研究发现三棱具有抗血小板聚集、镇痛、抗肿瘤等作用，而被认为是莪术特征成分的莪术醇在新近研究中发现能抑制肿瘤细胞生长及RNA的合成并诱导其凋亡［10-11］。半枝莲的主要活性成分为黄酮类，具有清热解毒、化瘀利尿之功效，是一种传统的抗肿瘤中药，郭丽华等发现半枝莲5个黄酮类单体对SKOV-3细胞增殖均具有明显抑制作用，并可增强卡铂的细胞毒作用［12］。陈皮功效理气健脾，燥湿化痰，钱士辉等研究发现其能使G2-M细胞减少，G0-G1期细胞增多，同时能促使癌细胞凋亡的作用［13］。木香能行气止痛、调中导滞，近年来大量药理学研究也证实木香中有效成分对多种癌细胞具有杀伤作用［14］。桔梗具有祛痰抗炎、免疫调节、抗肿瘤、保肝、心血管、镇痛等作用［15］。半夏燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结，赵永娟研究发现其主要成分半夏多糖具有抗肿瘤作用，可抑制PC12细胞生长及增殖，诱导细胞凋亡［16］。因此，大七气汤既符合中医治疗肿瘤清热解毒，活血化瘀之原则，又跟现代药理学理论研究相匹配，故疗效可观。

本实验结果表明，大七气汤加减方作用于卵巢癌荷瘤鼠，能减轻瘤重，各治疗组与模型对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）；各组肿瘤体积治疗末次后与模型对照组比较均减小（P＜0.01），大七气汤高剂量组、DDP组、DDP联合大七气汤组经组间比较差异无统计学意义（P＞0.01）；瘤重和瘤体积均以DDP联合大七气汤组作用最强，提示大七气汤辅助DDP化疗可以增强荷瘤鼠对DDP的敏感性，提高抑瘤效果。通过检测瘤体凋亡相关基因和蛋白的表达：DDP及大七气汤高、低剂量组均能上调卵巢癌移植瘤Caspase-3表达及下调Survivin表达，发挥促凋亡作用，化疗药物DDP的作用优于单纯大七气汤高、低剂量组，且DDP联合大七气汤组效果强于所有治疗组，亦说明单纯大七气汤治疗可促进卵巢癌移植瘤凋亡，而大七气汤联合化疗仍为最佳疗效组。

综上所述，大七气汤加减方可抑制卵巢癌移植瘤细胞生长，促进移植瘤细胞凋亡，增强卵巢癌移植瘤对DDP敏感性，其机制可能是上调Caspase-3表达，下调Survivin表达，诱导裸鼠体内卵巢癌细胞凋亡。

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［临床］

*通信作者：陈蓉（1963—），女，教授，硕士生导师，研究方向为妇科肿瘤与不孕症中医治疗。Te1：13512337203，E-mai1：cr8093 @126.com

作者简介：杨洋博君（1989—），女，硕士生，研究方向为中医药治疗妇科肿瘤与不孕症。Te1：13650534197，E-mai1：yybj1989@ 126.com