山柰酚对卵清蛋白诱导豚鼠过敏性鼻炎的保护作用

周运江， 王 虎， 李 丽， 随何欢， 黄家君

（重庆医科大学药理学教研室，重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆400016）



山柰酚对卵清蛋白诱导豚鼠过敏性鼻炎的保护作用

周运江， 王 虎， 李 丽， 随何欢， 黄家君*

（重庆医科大学药理学教研室，重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆400016）

摘要：目的 研究山柰酚对卵清蛋白诱导的豚鼠过敏性鼻炎的保护作用。方法 将50只雄性豚鼠随机分为5组，即正常组、卵清蛋白模型组、山柰酚（5 mg/kg）组、山柰酚（20 mg/kg）组、氯雷他定（2 mg/kg）组。除正常组和卵清蛋白模型组外，其余各组在造模成功后连续7 d给药。通过记录豚鼠抓鼻和打喷嚏次数，评价过敏性鼻炎的症状；ELISA试剂盒检测豚鼠血清中组胺、免疫球蛋白IgE、肿瘤坏死因子TNF-a和白细胞介素IL-4的水平；HE染色观察豚鼠鼻黏膜病理形态的改变；Western b1ot检测鼻黏膜组织中TNF-a和IL-4的表达量。结果 山柰酚能明显改善豚鼠过敏性鼻炎的症状（P＜0.05），降低血清中组胺、IgE、TNF-a和IL-4的水平（P＜0.05），降低鼻黏膜组织中TNF-a 和IL-4的表达水平（P＜0.05）。在光镜下观察，山柰酚会明显减少嗜酸性粒细胞的浸润。结论 山柰酚对卵清蛋白诱导的豚鼠过敏性鼻炎具有良好的保护作用。

关键词：山柰酚；卵清蛋白；过敏性鼻炎

过敏性鼻炎是一种常见的耳鼻咽喉科疾病。随着全球工业化的发展其发病率在逐渐增加，目前这种疾病影响了全球大约30％的人口，并且它在儿童和青年人群中的患病率日益增加。除此之外，在这些患鼻炎病的人群中，20岁之前患病的概率高达80％［1］。过敏性鼻炎是由IgE介导的过敏性疾病，它主要发生在鼻黏膜部位。虽然过敏性鼻炎不会威胁到病人的生命安全，但是鼻痒、鼻塞、打喷嚏和流鼻涕等一系列的鼻炎临床症状会严重影响到病人的生活质量［2］。现在有很多药物包括抗组胺类、皮质激素类、减充血剂和鼻内抗胆碱类药物被用来治疗过敏性鼻炎，但是这些药物的副反应和较低的临床效果仍然存在［3］。因此，找到更好的药物来治疗过敏性鼻炎已经迫在眉睫。

最近，人们对于从药用植物中所提取的具有生物活性的天然化合物来治疗过敏性疾病的兴趣日益增加［4］，其中所关注的焦点便是这些天然化合物的安全性和有效性问题。山柰酚（kaempfero1，结构式见图1）是一种从姜科植物山柰以及檀香科植物百蕊草（Thesium chinense Turcz）中所提取的黄酮类化合物，它广泛存在于各种蔬菜和水果中。有研究表明，山柰酚具有抗肿瘤［5］、抗炎［6］和抗氧化［7］等多种作用。在本次实验中，我们主要研究山柰酚对卵清蛋白诱导豚鼠过敏性鼻炎的保护作用。

图1　山柰酚的化学结构式Fig.1 Chem ical structure of kaemp ferol

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器 雄性豚鼠，体质量（300±10）g，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证编号SCXK渝2012-0001；氯雷他定片（上海先灵葆雅制药有限公司，批号国药准字H10970410）；山柰酚（Sigma，USA，批号K0133）；卵清蛋白（OVA，Sigma，USA，批号A5378）；组胺、IL-4、TNF-a和IgE ELISA试剂盒（C1oud-C1one Corp，USA，批号分别为CEA927Ge、SEA077Gu、SEA133Gu、SEA545Gu）；一抗TNF-a、IL-4、β-actin抗体（Ce11 Signa1ing Techno1ogy，USA，批号分别为3707S、12227S、4967S）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号ZB-2301）；BCA蛋白浓度测定试剂盒增强型（上海碧云天生物技术有限公司，批号P0010S）；ECL暗室化学发光试剂（上海碧云天生物技术有限公司，批号P0018）；电泳仪（Bio-Rad，USA）；倒置显微镜（O1ympus，Japan）；凝胶成像系统（Bio-Rad，USA）；台式高速冷冻离心机（Thermo，USA）；超声波细胞破碎仪（上海生析超声仪器有限公司）。

1.2 豚鼠鼻炎造模 选择豚鼠作为造模动物，具体步骤如下：配制0.5 mg/mL的卵清蛋白溶液和20 mg/mL的A1（OH）3溶液，两者1∶1混合。用此混合液对豚鼠进行腹腔注射使其全身过敏（0.1 mL/豚鼠，2周，一周3次）。2周后，用卵清蛋白溶液（2 mg/mL）对豚鼠鼻腔进行局部刺激（0.05 mL/豚鼠，1周，1次/d）。根据行为学观察确定造模成功以后，进行如下分组：正常组、OVA对照组、不同给药剂量的山柰酚组、氯雷他定组。对豚鼠进行连续1周灌胃给药（山柰酚5 mg/kg，山柰酚20 mg/kg，氯雷他定2 mg/kg），同时继续用2 mg/mL的卵清蛋白溶液刺激豚鼠鼻腔（1次/d）。在这期间，正常组和卵清蛋白对照组只使用生理盐水处理。

1.3 豚鼠鼻炎症状评价 在末次给药，卵清蛋白溶液（2 mg/mL）对豚鼠鼻腔进行局部刺激以后，将豚鼠放入观察笼中，观察15 min，记录各组豚鼠抓鼻和打喷嚏的次数。

1.4 检测豚鼠血清中组胺、IgE、TNF-a和IL-4的水平 在记录完各组豚鼠抓鼻和打喷嚏的次数24 h以后，用10％的水合氯醛麻醉豚鼠，股动脉取血，静置2 h，1 000 r/min、4℃下离心10 min，取上层血清。按照ELISA试剂盒操作方法，检测豚鼠血清中组胺、IgE、TNF-a和IL-4水平。

1.5 鼻黏膜组织学形态评价 取豚鼠头部，去除皮肤和组织，取出鼻中隔黏膜组织，浸泡在10％的福尔马林中48 h固定，组织在流动的水中冲洗后，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成4 μm厚切片，HE染色。在光学显微镜下观察鼻黏膜中嗜酸粒细胞的浸润情况。

1.6 Western b1ot检测鼻黏膜中TNF-a和IL-4的表达 取豚鼠鼻黏膜组织，加入细胞裂解液，超声细胞破碎仪低温匀浆，12 000 r/min、4℃离心10 min，取上清液，BCA法测定蛋白质的量。取30 μg的蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将凝胶中分离的蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶室温封闭2 h后，分别加入抗TNF-a、IL-4和βactin一抗溶液，4℃温育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗溶液，温育2 h，ECL暗室化学发光显影，凝胶成像分析系统摄像分析，采用Quantity One分析软件分析条带灰度值，蛋白表达相对值=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值

1.7 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件，实验数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 山柰酚对过敏性鼻炎豚鼠鼻部症状的影响图2结果显示，与正常组比较，卵清蛋白模型组豚鼠抓鼻（图2A）和打喷嚏（图2B）的次数明显增加（P＜0.01）。与卵清蛋白模型组相比，低剂量、高剂量山柰酚组和氯雷他定组豚鼠抓鼻和打喷嚏的次数会明显减少（P＜0.05）。

图2　山柰酚对豚鼠鼻炎症状的影响Fig.2 Effects of kaempferol on nasal symptoms in ovalbum in-induced guinea pigs

2.2 山柰酚对过敏性鼻炎豚鼠血清中组胺、IgE、TNF-a和IL-4水平的影响 图3结果显示，卵清蛋白模型组血清中组胺、IgE、TNF-a和IL-4水平均显著高于正常组（P＜0.01）。与卵清蛋白模型组比较，低剂量、高剂量山柰酚组和氯雷他定组豚鼠血清中组胺、IgE、TNF-a和IL-4水平会明显降低（P＜0.05）。

2.3 山柰酚对过敏性鼻炎豚鼠鼻黏膜组织形态的影响 HE染色结果显示，正常组豚鼠鼻黏膜中少见嗜酸性粒细胞，卵清蛋白模型组豚鼠鼻黏膜中有大量嗜酸性粒细胞，高剂量山柰酚组及氯雷他定组豚鼠鼻黏膜中嗜酸性粒细胞明显减少，结果见图4。

2.4 山柰酚对过敏性鼻炎豚鼠鼻黏膜中TNF-a和IL-4表达的影响 Western b1ot结果显示，TNF-a和IL-4在正常组豚鼠鼻黏膜中的表达水平很低，卵清蛋白模型组豚鼠鼻黏膜中TNF-a和IL-4会显著增加（P＜0.01）。与卵清蛋白模型组比较，低剂量、高剂量山柰酚组和氯雷他定组豚鼠鼻黏膜中TNF-a和IL-4会显著降低（P＜0.05），结果见图5。

3 讨论

过敏性鼻炎是由IgE介导，以Th2型过敏反应为特征的一类过敏性疾病。过敏性鼻炎在发病的过程中主要涉及到鼻黏膜中嗜酸性细胞的浸润、肥大细胞的聚集和T细胞的活化［8］。有研究表明［9］，肥大细胞在过敏性鼻炎的早期阶段中发挥着非常重要的作用，当特异性个体接触到过敏原以后就会由IgE介导，与肥大细胞表面受体FcεRI进行结合，使肥大细胞脱颗粒释放组胺、白三烯和细胞因子等相关炎症介质，这些炎症介质会产生鼻痒、打喷嚏、流鼻涕等症状。过敏性鼻炎的晚期反应阶段主要是细胞性活动，由组胺和细胞因子活化的嗜酸性粒细胞是发挥主要作用的炎性细胞之一。同时，活化的Th2细胞所产生的细胞因子在诱导和维持过敏炎症反应发挥着重要的作用。晚期阶段的症状和早期阶段的症状基本相似，不同是这些症状会有不同程度的加重，并且伴随鼻腔的充血和黏液的分泌。

图3　山柰酚对豚鼠血清中组胺、IgE、TNF-a和IL-4水平的影响Fig.3 Effects of kaemp ferol on the serum levels of histam ine，IgE，TNF-a and IL-4 in ovalbum in-induced guinea pigs

图4　山柰酚对豚鼠鼻黏膜组织病理形态的影响Fig.4 Effect of kaempferol on the histopathological changes of nasalmucosa in ovalbum in-induced guinea pigs

T细胞（Th1和Th2）在超敏反应的过程中发挥着至关重要的作用，它能够识别抗原呈递细胞。在正常的情况下，Th1细胞和Th2细胞是处于动态平衡的状态，这可以调节机体的免疫防御。当Th1细胞和Th2细胞处于非动态平衡的状态时，Th1或Th2细胞会出现过度的活化状态。有研究表明，过敏性疾病主要是Th2型的过敏反应［10］。在过敏性鼻炎的病理过程中，过敏原会诱导Th2细胞的增殖，使IL-4、IL-5、IL-9、IL-13的分泌增加，这些细胞因子会促进IgE的产生、嗜酸性粒细胞和肥大细胞的活化［11］。近年来，IL-4是研究较多的一种细胞因子，具有非常广泛的生物学作用，同时IL-4对IgE的产生具有显著的促进作用［12］。在本项研究中，作者观察到山柰酚会明显抑制过敏性鼻炎豚鼠鼻黏膜中IL-4的表达，降低过敏性鼻炎豚鼠血清中IL-4 和IgE水平，抑制嗜酸性粒细胞等炎性细胞的浸润。这表明，山柰酚能够通过调节Th1和Th2淋巴细胞亚群的平衡来改善过敏性鼻炎的症状。

肥大细胞是过敏性鼻炎发生过程中最重要的细胞之一，它被过敏原激活脱颗粒以后，会释放出组胺，随后会分泌与炎症反应相关的细胞因子［13-14］。组胺在过敏性鼻炎发病的过程中具有非常重要的作用，它会引起鼻黏膜中毛细血管的扩张、通透性增高、腺体分泌增加，进而造成局部黏膜水肿。促炎细胞因子TNF-a与过敏性鼻炎密切相关，它是重要的多功能促炎细胞因子，可以使血管内皮细胞表达黏附分子促进炎症细胞的聚集，同时也可以刺激组胺，前列腺素等因子的释放［15］。有研究表明［16-17］，当鼻部出现炎症反应时，鼻黏膜下TNF-a表达会明显增加，同时血液中组胺和TNF-a的水平也会有一定程度的增加。本项研究中作者发现，山柰酚会明显的减少过敏性鼻炎豚鼠鼻黏膜中TNF-a的表达，同时降低血清中组胺和TNF-a的水平。这表明，山柰酚可以通过下调组胺和TNF-a水平改善过敏性鼻炎的症状。

综上所述，山柰酚能够降低卵清蛋白诱导的过敏性鼻炎豚鼠模型血清中组胺、IgE、TNF-a和IL-4的水平，抑制鼻黏膜组织中TNF-a和IL-4的表达水平，减少鼻黏膜组织中嗜酸性粒细胞的浸润，从而改善过敏性鼻炎的症状。这些表明，山柰酚对卵清蛋白诱导豚鼠过敏性鼻炎有很好的保护作用。

1.正常组 2.卵清蛋白模型组 3.山柰酚组（5 mg/kg） 4.山柰酚组（20 mg/kg） 5.氯雷他定组（2 mg/kg）1.norma1group 2.1ecithin group 3.kaempfero1group（5 mg/kg） 4.kaempfero1group（20 mg/kg） 5.Loratadine group（2 mg/kg）图5　山柰酚对豚鼠鼻黏膜中TNF-a和IL-4表达的影响Fig.5 Effects of kaempferol on the expressions of TNF-a and IL-4 in ovalbum in-induced guinea pigs

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Protective effect of kaem p ferol against ovalbum in-induced allergic rhinitis in guinea pigs

ZHOU Yun-jiang， WANG Hu， LILi， SUIHe-huan， HUANG Jia-jun*
（Department of Pharmacology，Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology；Chongqing Medical University，Chongqing 4OOO16，China）

ABSTRACT：AIM To investigate the protective effect of kaempfero1against ova1bumin（OVA）-induced a11ergic rhinitis in guinea pigs.METHODS Fifty guinea pigswere random1y divided into five groups，inc1uding norma1 group，ova1bumin mode1 group，kaempfero1（5 mg/kg and 20 mg/kg）treated groups and 1oratadine （2 mg/kg）treated group.The drug groups were given drugs once dai1y via gavage for seven consecutive days. Norma1and ova1bumin mode1groupswere given sa1ine a1one on the same schedu1e.The numbers of rubbingmovement and sneezeswere recorded to eva1uate the symptoms of a11ergic rhinitis.The concentrations of histamine，IgE，TNF-a and IL-4 in serum weremeasured by ELISA assay.The histopatho1ogica1changes of nasa1mucosa were observed by 1ightmicroscope after HE staining.Western b1otwas emp1oyed to test the TNF-a and IL-4 expressions in nasa1mucosa.RESULTS Kaempfero1significant1y improved the symptoms of a11ergic rhinitis（P＜0.05），de-book=25,ebook=31creased the 1eve1s of histamine，IgE，TNF-a and IL-4 in serum（P＜0.05），and inhibited the expressions of TNF-a and IL-4 in nasa1mucosa（P＜0.05）.In addition，kaempfero1marked1y reduced the infi1tration of eosinophi1in nasa1mucosa.CONCLUSION Kaempfero1 has significant protective effect against ova1bumin-induced a11ergic rhinitis in guinea pigs.

KEY WORDS：kaempfero1；ova1bumin；a11ergic rhinitis

*通信作者：黄家君（1964—），男，副教授，硕士生导师，研究方向为抗肿瘤药理与抗炎免疫药理。Te1：（023）68485161，E-mai1：huangjiajuncqmu@163.com

作者简介：周运江（1990—），男，硕士生，研究方向为抗肿瘤药理与抗炎免疫药理。Te1：18223173440，E-mai1：zyjcqmu@163.com

基金项目：重庆市科委自然科学基金（CSTC，2010BB5111）；重庆市教委自然科学基金（KJ100308）

收稿日期：2015-02-01

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.005

中图分类号：R966

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）01-0024-06

网络出版日期：2015-08-11

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150811.1211.002.htm1