羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀对抗大鼠缺血再灌注心肌炎症反应和凋亡

史晓静， 赵 琳， 王高频， 陶贵周

（辽宁医学院附属第一医院心内科，辽宁锦州121001）



羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀对抗大鼠缺血再灌注心肌炎症反应和凋亡

史晓静， 赵 琳， 王高频， 陶贵周

（辽宁医学院附属第一医院心内科，辽宁锦州121001）

摘要：目的 观察羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀预处理对大鼠心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和白介素-1（inter 1eukin-1，IL-1）、心肌细胞内Caspases-3和NF-κB表达的影响，探讨其心肌保护作用机制。方法 将40只雄性SD大鼠随机等分为4组，假手术组（生理盐水5 mL/d）、缺血再灌注组（生理盐水5 mL/d）、阿托伐他汀预处理组［阿托伐他汀20 mg/（kg.d）］和羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀预处理组［羟基红花黄色素A 10 mg/（kg.d）+阿托伐他汀20 mg/（kg.d）］。灌胃7 d后，第8天制作大鼠在体心肌I/R模型，结扎左冠状动脉前降支30 min，再灌注120 min后，各组术后分别应用心脏超声检测心功能指标，HE染色观察心肌组织病理学变化，用ELISA法检测心肌中TNF-a和IL-1β浓度，Western b1ot检测活化Caspase-3和NF-κB的表达。结果 与缺血再灌注组比较，阿托伐他汀预处理组心功能指标、组织病理改变明显改善（P＜0.05），羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀预处理组改善更显著；与缺血再灌注组比较，阿托伐他汀预处理组TNF-a和IL-1β浓度明显减少（P＜0.05），Caspases-3和NF-κB表达明显减少（P＜0.05）；与阿托伐他汀预处理组比较，羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀预处理组TNF-a、IL-1β、Caspases-3及NF-κB表达减少更为明显（P＜0.05）。结论 羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀预处理明显抑制炎症反应，减少细胞凋亡，减轻MIRI损伤，呈现加强的心肌保护作用，其机制可能与抑制心肌NF-KB表达有关。

关键词：心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）；羟基红花黄色素A；阿托伐他汀；炎症反应；凋亡

心肌缺血再灌注损伤（myocardia1ischemia reperfusion injury，MIRI）在临床上十分常见，病理生理过程复杂，其发生机制可能与多种因素有关，细胞凋亡可能是MIRI发病机制中的一个重要环节［1］。研究发现，羟基红花黄色素A和阿托伐他汀具有明显的心血管保护作用，但二者合用是否可有相互增强作用及机制目前尚不明确。本研究建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，观察羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀预处理对心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响，并探讨可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 羟基红花黄色素A（山东省天然药物工程技术研究中心，纯度≥98％）；阿托伐他汀（立普妥，辉瑞制药有限公司，20 mg×7片/盒）；兔抗鼠Caspase-3多克隆抗体，购自美国Ce11Signa1ing Techno1ogy公司；兔抗NF-κB多克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechno1ogy公司；二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔1gG抗体，购自美国Santa Cruz公司；内参照物购自武汉博士德公司。

1.2 动物及分组 健康成年雄性SD大鼠40只，体质量200～250 g，由辽宁医学院动物实验中心提供，动物合格证号SYXK（辽）2013-0005号。随机分为假手术组（生理盐水5 mL/d）、缺血-再灌注组（生理盐水5 mL/d）、阿托伐他汀预处理组［（阿托伐他汀20 mg/（kg.d）］和羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀预处理组［羟基红花黄色素A 10 mg/（kg.d）］和阿托伐他汀［20 mg/（kg.d）］，每组10只。灌胃7 d后，第8天制作大鼠在体心肌I/R模型。

1.3 模型制备 参照相关文献，采用阻断大鼠冠状动脉左前降支建立缺血再灌注损伤动物模型。将大鼠乙醚麻醉下仰位固定于手术台，自左侧3～4肋间开胸，暴露心脏，于肺动脉圆锥及左心房间找出冠状动脉左前降支，假手术组仅穿线不结扎，其余各组均以0号线快速结扎左冠脉，缺血30 min后再次开胸，剪断丝线使血流再通，复灌120 min后处死动物，取出心脏。所有大鼠术前禁食、禁饮，麻醉后气管插管，接动物呼吸机控制呼吸；接好生理记录仪；开放尾静脉输液；全程记录和分析心电图、心率（HR）的变化。

1.4 给药方法 各组动物均于模型制作前7 d灌胃给药，每日1次，连续7次，A组和B组灌胃生理盐水5 mL/kg，C组和D组分别灌胃阿托伐他汀［20 mg/（kg.d）（溶于生理盐水中）］，D组腹腔注射羟基红花黄色素A 10 mg/（kg.d）。

1.5 检测指标 再灌注120 min后，各组术后分别应用心脏超声检测心功能指标，HE染色观察心肌组织病理学变化，每组大鼠应用ELISA法检测心肌中TNF-a和IL-1β浓度。试剂均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，操作步骤严格按照说明书进行。Western b1ot方法检测活化Caspase-3和NF-κB的表达。

1.6 统计学处理 数据用均数±标准差表示，采用SPSS 13.0统计软件处理，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心功能指标 各组术后心率差异不显著（P＞0.05）。与假手术组相比，缺血-再灌注组左心室收缩压（1eft ventricu1ar systo1ic pressure，LVSP）及左心室射血分数（1eft ventricu1ar ejection fraction，LVEF）显著降低，左心室舒张末压（1eft ventricu1ar end diasto1ic pressure，LVEDP）显著增高（P＜0.05）；与缺血-再灌注组比较，阿托伐他汀预处理组LVSP及LVEF显著增高，LVEDP显著降低（P均＜0.05），羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀预处理组改善更明显。见表1。

表1　各组大鼠心功能指标比较（±s）

表1　各组大鼠心功能指标比较（±s）

注：与假手术组比较，#P＜0.05；与缺血-再灌注组比较，*P＜0.05；与阿托伐他汀预处理组比较，**P＜0.05

组别　LVSP/mmHg　LVEDP/mmHg　　心率次/min　LVEF/％假手术组150.2±3.2　1.7±0.2　342±10　82.56±3.80缺血-再灌注组　96.1±3.8#　11.2±2.0#　344±11　63.40±3.05#阿托伐他汀组　122.3±4.1*　4.8±1.6*　340±9　72.68±3.55*联合组　146.8±4.4**　2.3±0.8**　341±7　79.86±4.15**

2.2 心肌组织病理学改变 镜下观察发现，正常组心肌细胞排列整齐，肌纤维横纹清晰，未见变性或坏死以及炎细胞浸润。模型组细胞排列紊乱，明显肿胀，肌纤维部分断裂，横纹模糊或消失，片状坏死区细胞核碎裂或崩解，炎性浸润明显。阿托伐他汀预处理组心肌细胞排列较整齐，部分细胞水肿变性，肌纤维间隙水肿，偶见炎性细胞浸润。羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀预处理组组心肌细胞数量和结构恢复较好，坏死和炎性症象有所减轻，有效地对抗心肌细胞损伤。

2.3 炎症因子变化 与假手术组比较，缺血-再灌注组大鼠TNF-a和IL-1β浓度明显增加（P＜0.05）；与缺血-再灌注组比较，阿托伐他汀预处理组TNF-a和IL-1β质量浓度明显减少（P＜0.05）；与阿托伐他汀预处理组比较，羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀预处理组减少TNF-a和IL-1β质量浓度更为明显（P＜0.05）。见表2。

表2　各组大鼠心肌TNF-a和IL-1β浓度变化（±s）

表2　各组大鼠心肌TNF-a和IL-1β浓度变化（±s）

注：与假手术组比较，#P＜0.05；与缺血-再灌注组比较，*P＜0.05；与阿托伐他汀预处理组比较，▲P＜0.05

组别　　动物数　　剂量　TNF-a/（ng.mL-1）IL-1β/（ng.mL-1）假手术组10　-　5.70±1.54　1.33±0.13缺血-再灌注组　10　-　52.24±7.97#　12.96±1.28#阿托伐他汀组　10　20 mg/（kg.d）　25.42±4.18*　6.10±0.94*联合组　10　　羟基红花黄色素A 10 mg/（kg.d）+阿托伐他汀20 mg/（kg.d）　17.07±3.86▲　3.16±0.41▲

2.4 Caspase-3蛋白表达 与假手术组比较，缺血-再灌注组Caspase-3蛋白表达明显增加（P＜0.05）；与缺血-再灌注组比较，阿托伐他汀预处理组Caspase-3蛋白表达明显减少（P＜0.05）；与阿托伐他汀预处理组比较，羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀预处理组Caspase-3蛋白表达减少更为明显（P＜O.05）。见表3。

表3　各组大鼠心肌组织Caspase-3蛋白表达的变化（±s）

表3　各组大鼠心肌组织Caspase-3蛋白表达的变化（±s）

注：与假手术组比较，#P＜0.05；与缺血-再灌注组比较，*P＜0.05；与阿托伐他汀预处理组比较，▲P＜0.05

Caspase-3假手术组组别　　动物数　　剂量1.08±0.06缺血-再灌注组　10　-　5.96±0.39#阿托伐他汀组　10　20 mg/（kg.d）　3.28±0.19*联合组　10　　羟基红花黄色素A 10 mg/（kg.d）+阿托伐他汀20 mg/（kg.d）　 2.06±0.16 10　-▲

2.5 NF-κB表达 与假手术组比较，缺血-再灌注组NF-κB表达明显增加（P＜0.05）；与缺血-再灌注组比较，阿托伐他汀预处理组NF-κB表达明显减少（P＜0.05）；与阿托伐他汀预处理组比较，羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀预处理组NF-κB表达减少更为明显（P＜0.05）。见表4。

表4　各组大鼠心肌组织NF-κB表达的变化（±s）

表4　各组大鼠心肌组织NF-κB表达的变化（±s）

注：与假手术组比较，#P＜0.05；与缺血-再灌注组比较，*P＜0.05；与阿托伐他汀预处理组比较，▲P＜0.05

组别　　动物数　　剂量NF-κB假手术组3.08±0.20缺血-再灌注组　10　-　10.86±0.61#阿托伐他汀组　10　20 mg/（kg.d）　6.02±0.59*联合组　10　　羟基红花黄色素A 10 mg/（kg.d）+阿托伐他汀20 mg/（kg.d）　4.06±0.38 10　-▲

3 讨论

研究显示，心肌缺血再灌注损伤与炎症因子产生、内皮损伤、细胞凋亡及核转录因子调控等机制有关。心肌缺血阶段炎症反应即被激活，再灌注则明显加剧了心肌的炎症反应。此病理生理过程激活机体炎症细胞释放大量促炎因子：如白介素-1（inter 1eukin-1，IL-1）、IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）及干扰素等并且调节特异性免疫细胞反应，引起比原打击更大损伤的炎症反应。而心肌缺血再灌注损伤便是炎症反应过度表达，系统炎症反应和局部炎症反应共同参与的结果［2-6］。

细胞凋亡是缺血再灌注损伤后细胞死亡的主要方式。Caspase-3是启动凋亡程序的关键蛋白酶。Cspase-3表达的增加、激活是外源性的死亡受体途径和内源性的线粒体途径2种凋亡信号转导路径中共同的关键环节，因此是凋亡发生的标志酶［7］。本研究表明，缺血再灌注组Caspase-3表达比假手术组明显增加，提示缺血再灌注过程中出现了大量的细胞凋亡。

NF-κB是一种广泛存在于多种不同细胞，具有调控细胞因子、化学因子及立早蛋白等功能的转录因子，是一个对氧化还原状态敏感的转录因子，对炎症反应、免疫应答、细胞生存和增生都具有调节作用，是一个参与炎症反应新的作用靶点［8-9］。NF-κB的异常激活与心肌细胞凋亡有密切关系［10-11］。在本研究中，缺血再灌注组NF-κB表达明显增加，提示其参与了缺血再灌注损伤的病理过程。

红花是非常重要的中草药，内含红色素和黄色素2种色素。红花黄色素是从红花花瓣中提取的天然色素，属于查耳酮类化合物，具有扩张冠状动脉血管、抗氧化、保护心肌、降血压、免疫抑制等多种药理功能。羟基红花黄色素A为红花主要水溶性有效成分。阿托伐他汀具有抗炎、抗栓、抗氧化、调节免疫、改善内皮功能、抑制血管平滑肌增殖等作用。近年来研究发现，阿托伐他汀可能通过多种途径及机制发挥抗氧化、抗凋亡等多种心肌保护作用［12］。本研究显示I/R后大鼠收缩及舒张功能均受损，组织损伤严重，采用阿托伐他汀治疗后LVSP、LVEDP、LVEF及组织结构有所改善，联合组改善效果更明显。本实验也证实阿托伐他汀组TNF-a和IL-1β质量浓度明显减少；联合组TNF-a和IL-1β质量浓度（P＜0.05）减少更为明显。表明二者联合能更有效降低心肌TNF-a和IL-1β质量浓度，减轻炎症反应，减轻再灌注损伤。此外阿托伐他汀组Caspase-3表达明显减少；联合组Caspase-3表达减少更为明显。表明二者联合能更有效抑制心肌细胞凋亡。在本研究中还显示，阿托伐他汀预处理能明显减少NF-κB表达（P＜0.05），联合组减少NF-κB表达效果更加明显。提示二者联合可能通过抑制NF-κB表达从而对抗炎症反应，降低心肌细胞凋亡，减轻再灌注损伤。

总之，细胞凋亡是缺血再灌注损伤中重要的病理生理机制，羟基红花黄色素A联合阿托伐他汀预处理能减轻心肌炎症反应，减少心肌细胞凋亡，改善心功能，二者联合表现出更加明显的心肌保护作用，其机制可能与抑制NF-κB表达有关。

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作者简介：史晓静（1973—），女，博士生，研究方向为冠心病和心律失常。Te1：13941622062，E-mai1：shixiaojing3000@163.com

收稿日期：2014-09-18

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.039

中图分类号：R966

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）01-0170-03